Développement d'un RT colorimétrique optimisé

Apr 04, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21424 (2022) Citer cet article

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La pandémie de coronavirus a accentué le besoin de tests de diagnostic moléculaire. Une technique très utilisée à cette fin est la réaction en chaîne par polymérase (PCR) - une technique sensible et spécifique couramment utilisée comme étalon-or pour les diagnostics moléculaires. Cependant, cela nécessite un personnel hautement qualifié et un équipement nécessitant beaucoup d'entretien et prend relativement du temps. Une alternative est la technique d'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP), qui ne nécessite pas de purification d'échantillon ni d'équipement coûteux, et est similaire à la PCR en termes de sensibilité et de spécificité. Dans cet article, nous avons développé un test au point d'intervention colorimétrique optimisé pour l'amplification isotherme par boucle de transcriptase inverse (RT-LAMP) à l'aide d'un appareil portable pour diagnostiquer le COVID-19. Des variables telles que la concentration des amorces, le sulfate de magnésium, la bétaïne, le chlorhydrate de guanidine, la Bst et la température des réactions ont été testées. Nous avons également créé un système de contrôle de la qualité du pipetage - utilisant une combinaison de colorants - pour éviter les faux négatifs dus à un manque d'échantillons ajoutés au tube à essai de réaction. De l'huile minérale a été incorporée dans la composition des réactions RT-LAMP pour éviter l'évaporation lorsqu'un couvercle chauffant n'est pas disponible. Le test RT-LAMP final est dix fois plus sensible que le mélange maître colorimétrique WarmStart de New England Biolabs avec une sensibilité de 5 copies par μL.

En décembre 2019, le monde a été témoin de l'apparition d'un nouveau coronavirus, nommé Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, ou SARS-CoV-2. Le premier cas d'infection par le SRAS-CoV-2 a été signalé à Wuhan, en Chine, et s'est rapidement propagé dans le monde entier, étant notifié comme une nouvelle pandémie en mars 20201. L'apparition de la pandémie a révélé le besoin mondial de biologie moléculaire des tests pour identifier, isoler et traiter les personnes infectées comme moyen de contrôler la propagation de la maladie.

La réaction en chaîne par polymérase de transcriptase inverse (RT-PCR)2 est communément connue comme la technique de référence pour les tests moléculaires des virus à ARN, tels que le SRAS-CoV-2. La RT-PCR est une technique avec une sensibilité et une spécificité élevées, mais elle nécessite un équipement coûteux et à maintenance élevée, des étapes de purification d'échantillons étendues et un personnel hautement qualifié. Avec l'augmentation rapide du nombre de personnes infectées, le manque de réactifs, d'intrants, de personnel et d'équipements pour les tests moléculaires est devenu évident, et le monde a connu une pénurie de ressources de laboratoire pour répondre à la demande.

L'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) a été décrite pour la première fois par Notomi et ses collègues en 20003 comme une technique d'amplification d'acide nucléique avec une spécificité et une efficacité élevées, pouvant être réalisée dans des conditions isothermes. Il utilise une ADN polymérase à déplacement de brin (dépourvue d'activité exonucléase 5′ → 3′) et un ensemble de deux à trois paires d'amorces conçues pour créer des boucles dans l'ADN simple brin synthétisé. Chaque fois que la polymérase démarre une nouvelle amplification, elle libère le brin d'ADN précédemment apparié, qui forme une structure en boucle qui contient de nouveaux sites de liaison pour la polymérase, créant ainsi une amplification auto-propagée. Les produits finaux de la réaction sont des structures en forme de chou-fleur avec de multiples boucles formées par recuit entre des répétitions alternativement inversées de la cible3. En plus de la PCR, les réactions LAMP peuvent également être couplées à une enzyme transcriptase inverse pour effectuer une amplification des molécules d'ARN.

Le degré élevé de synthèse d'ADN se produisant dans les réactions LAMP permet la détection visuelle d'une réaction positive. Chaque fois que l'ADN polymérase incorpore un dNTP dans le brin d'ADN nouvellement synthétisé, elle libère un pyrophosphate et une molécule de proton comme sous-produit. Le pyrophosphate, en présence d'ions Mg2+, précipite sous forme de pyrophosphate de magnésium modifiant la turbidité de la réaction. Le proton libéré diminue le pH de la réaction, ce qui peut être détecté en utilisant un colorant colorimétrique sensible au pH tel que le rouge de phénol et le bleu de bromothymol4,5.

Les tests d'amplification colorimétrique isotherme des acides nucléiques (TAAN) ont joué un rôle central dans la réponse à la pandémie de COVID-19. Au-delà du fait que ceux-ci ne nécessitent pas de thermocycleur, le traitement des échantillons est également simplifié6, et les résultats peuvent être déterminés à l'œil nu. Ces techniques ont été appliquées avec succès aux points de soins et de traitement (POCT), avec des capteurs numériques facilitant le contrôle et l'analyse des réactions. Au-delà de la configuration simple, la RT-LAMP colorimétrique peut également être utilisée dans les tests de diagnostic POCT avec détection RVB (rouge, vert, bleu) pour une précision accrue tout en excluant le besoin de filtres et de détecteurs expansifs. L'analyse des données d'évolution dans le temps peut produire des courbes d'amplification similaires aux systèmes fluorescents7.

Ici, nous effectuons un développement systématique d'un test colorimétrique RT-LAMP ciblant le SRAS-CoV-2, optimisé pour une utilisation dans le dispositif Hilab® Molecular POCT, y compris le réglage fin de la concentration du réactif, les procédures de contrôle de la qualité pour l'opérateur, la gestion de l'évaporation et la stabilité .

La matrice expérimentale complète était composée de 192 conditions différentes (tableau S1). Un modèle a été défini pour chaque paramètre de réponse, pour les réactions positives et négatives, et les facteurs ont été maintenus ou supprimés sur la base d'un diagramme de Pareto des effets standardisés, avec alpha (α) = 0,05. Nous avons effectué les expériences avec un seul réplicat, et les valeurs aberrantes ont été supprimées manuellement en fonction de la forme de la courbe et des résultats attendus. La figure 1 illustre l'analyse des résultats de l'expérience, y compris les profils de résidus et les parcelles de probabilité normale. L'ajustement du modèle a été jugé acceptable en raison du profil de distribution des résidus. L'ANOVA des modèles se trouve sur la Fig. 2, et la Fig. 3 illustre l'optimisation de la réponse visant à minimiser le temps initial d'amplification (Xt) et le temps de réaction (TTR) - le temps nécessaire pour atteindre 50 % du delta d'amplification. —des réactions positives et minimiser le Nmax (Delta du changement de couleur entre la couleur initiale et la couleur finale de la réaction) des réactions négatives.

Analyse des résultats de l'expérience visant à minimiser la réponse Time To Reaction (TTR) des réactions positives, obtenue avec le logiciel Minitab. Dans (A) Parcelles résiduelles. Le diagramme de probabilité normale indique que les résidus analysés sont normalement distribués. L'histogramme représente la distribution des résidus. Le graphique des résidus par rapport aux ajustements montre que les résidus sont distribués de manière aléatoire, et le graphique des résidus par rapport à l'ordre indique les résidus dans l'ordre dans lequel les données ont été collectées, ce qui montre que les résidus sont indépendants puisqu'il n'y a pas de modèles dans l'ordre d'observation. (B) Tracé de probabilité normale avec α = 0,05, où les facteurs significatifs, dans l'ordre, étaient : la séquence d'amorces (F), la concentration de Bst (B), la concentration d'amorces (A), la concentration de sulfate de magnésium (C) et la combinaison de séquence de l'amorce et ajustement du pH du chlorhydrate de guanidine (FG).

ANOVA de la réponse TTR obtenue à partir du logiciel Minitab avec les facteurs testés et la valeur P respective. Les facteurs tels que la concentration d'amorce ([Primer]), la concentration de Bst ([Bst]), la concentration de sulfate de magnésium ([MgSO4]) et la séquence d'amorce (Primer) étaient statistiquement significatifs, p < 0,05.

Optimisation de la réponse obtenue à partir de Minitab en minimisant la positivité initiale (Ini_post) et le TTR (TTR_post) des réactions positives, et en minimisant le Nmax (Delta des couleurs) des réactions négatives avec une désirabilité de 0,989. Pour obtenir la réponse optimale, le modèle final était une amorce à une concentration unique, Bst à 0,4 U/μL (équivalent à 50 %), du sulfate de magnésium à 8 mM, de la bétaïne à 400 mM, des amorces ciblant la séquence N et Orf1ab et une température de 67 °C. °C.

La modélisation des résultats de la réponse TTR des réactions positives donne la séquence d'amorce, la concentration en enzyme, le sulfate de magnésium et la concentration d'amorce comme facteurs significatifs, dans cet ordre. La modélisation pour la détermination manuelle du début d'amplification (Xt) et du point d'inflexion à l'aide d'une régression non linéaire était essentiellement la même. Une optimisation pour minimiser les variables de réponse modélisées a été effectuée et des diagrammes factoriels et de désirabilité ont été utilisés pour déterminer les plages d'intérêt pour les facteurs analysés. La concentration d'amorce à un facteur (la valeur maximale testée) s'est avérée optimale, des concentrations plus faibles provoquant une augmentation des valeurs de TTR. Des températures plus élevées ont eu un effet positif sur les temps de réaction. Le type de séquence d'amorce était pire pour la paire NE, et à peu près le même pour les deux combinaisons restantes, tandis que l'ajustement du pH de la solution mère de chlorhydrate de guanidine (Gu-HCl) semble avoir peu ou pas d'effet sur les réponses évaluées.

Le modèle pour le Nmax des réactions de contrôle négatif a également été accepté, avec un R2 de 67,28 %. Les tracés factoriels du modèle indiquent une propension à l'amplification non spécifique pour des concentrations accrues de polymérase et de sulfate de magnésium. Une relation inverse entre la concentration de bétaïne est observée. Des températures plus basses, comme prévu, augmentent les chances d'amplification non spécifique.

Grâce au logiciel Minitab, nous pouvons prendre en compte les trois modèles (minimiser le TTR et le temps initial d'amplification (Xt) des réactions positives et minimiser le Nmax des réactions négatives) pour prendre la meilleure décision pour chaque variable analysée. Avec Minitab, nous pouvons agréger l'importance de chaque réponse analysée pour donner un meilleur ajustement en tenant compte de tous les paramètres de réponse. Ici, les trois réponses ont la même importance (un poids de 1), cependant, en considérant que dans deux des trois réponses analysées, le paramètre temps (TTR et temps initial) compte pour \({\raise0.5ex\hbox{ $\scriptstyle 2$} \kern-0.1em/\kern-0.15em \lower0.25ex\hbox{$\scriptstyle 3$}}\) du résultat pour choisir les variables. En tenant compte des trois modèles, le logiciel propose les niveaux optimaux. Les meilleurs facteurs après ce tour d'optimisation étaient une concentration d'amorces, 0,5 fois de Bst (0,4 U/μL), 8 mM de sulfate de magnésium et 400 mM de bétaïne, avec une réaction de température de 67 °C. La combinaison d'amorces choisie était la 1AN (gène N et séquence Orf1ab).

En utilisant la condition optimisée mentionnée ci-dessus, nous n'avons pas observé de résultats faussement positifs même après une amplification de 60 minutes (fichier supplémentaire).

Les plages de pH de changement de couleur pour chaque colorant indicateur testé sont présentées dans le tableau 1.

Nous avons analysé les indicateurs de pH en fonction de la complexité de la préparation des solutions mères, de la stabilité dans le temps et des températures, de la précipitation des colorants et de la plage de pH par rapport au changement de couleur. Nous avons évalué les colorants dans le dispositif Molecular HilabⓇ dans différents volumes de réaction car ils peuvent influencer la saturation de la couleur. Selon le fabricant, l'enzyme Bst est stable à des pH de 5 à 10, les colorants qui étaient en dehors de cette plage ou trop proches des deux extrémités basses et hautes ont été ignorés en tant qu'indicateurs potentiels. La figure S1 montre le gradient de couleur pour chaque colorant indicateur de pH testé.

Le violet de métacrésol ne s'est pas complètement dissous dans de l'eau ultra-pure sans nucléase de type 1 ou dans un tampon TE, il a donc été éliminé des tests ultérieurs. Étant donné que le dispositif Molecular HilabⓇ affiche le résultat de la réaction sous forme de séries temporelles colorées, l'utilisation de colorants indicateurs de pH qui commencent par une solution incolore pourrait être interprétée comme une non-insertion des tubes de réaction. Pour cette raison, l'o-crésolphtaléine et l'α-naphtolphtaléine ont été rejetées comme indicateurs potentiels.

Le bleu de bromothymol et le violet de bromocrésol ont montré un bon changement de couleur (du bleu foncé et du violet au jaune, respectivement) et une bonne stabilité. Le rouge de crésol et le rouge de chlorophénol ont donné des résultats similaires au rouge de phénol, qui est déjà utilisé dans le mélange LAMP Master de NEB. Après le criblage, le bleu de bromothymol a été élu comme indicateur de pH le plus stable, présentant un grand changement de couleur, du bleu au jaune, ce qui correspond à une différence de 180° dans l'échelle des teintes. La concentration optimale du bleu de bromothymol dans la réaction RT-LAMP a été testée et définie à 100 μM, car les concentrations inférieures à celle-ci ont entraîné une couleur bleu clair et au-dessus, elle a augmenté la réaction TTR (données non présentées).

Nous avons testé l'ajout de 1 à 4 µL de KOH 10 mM (hydroxyde de potassium) pour évaluer l'influence du pH de départ de la réaction. Les paramètres analysés étaient TTR et Nmax. Fait intéressant, aucune différence significative n'a été observée dans les deux paramètres. Cependant, la condition avec le TTR le plus bas et le Nmax le plus élevé a été obtenue avec 1,2 mM de KOH dans la réaction finale. Le Nmax était d'environ 54 (± 4) avec un TTR de 420 s lorsqu'un contrôle positif était utilisé (1 × 106 équivalents génome / réaction) (Fig. S2).

En tant que test au point de service, notre objectif était de développer un kit qui minimiserait et simplifierait la manipulation pour l'opérateur. Dans le but de faciliter la procédure, nous avons testé certaines combinaisons de colorants dans la solution échantillon. Ce faisant, l'opérateur serait en mesure de voir si l'échantillon a été ajouté au tube de réaction et si le volume pipeté était correct, évitant ainsi les résultats faussement négatifs par manque d'ajout d'échantillon. Étant donné que des travaux antérieurs avaient montré qu'une combinaison de colorants indicateurs de pH pouvait être utilisée dans les réactions LAMP8, nous avons testé la combinaison de bleu de bromothymol avec du rouge de phénol ou du rouge de crésol dans nos réactions.

La combinaison de bleu de bromothymol et de rouge de crésol a donné une couleur bleuâtre boueuse après l'ajout de l'échantillon (Fig. 4—tubes 25–32). Après une amplification de 30 minutes, la couleur des tubes témoins positifs (33–35 et 37–39) pouvait être légèrement distinguée des témoins sans matrice (NTC) (tubes 36 et 40). Le rouge de phénol a été élu meilleur colorant à utiliser dans la composition de la solution échantillon. Après l'ajout de l'échantillon, la couleur de la réaction est passée du bleu (tubes 1 à 8) au violet (tubes 9 à 16), ce qui représente un changement de couleur perceptible pour l'opérateur. Dans le cas de l'amplification, la couleur finale était un jaune vif (tubes 17–19 ; 21–23) et se distinguait clairement des tubes NTC (20 et 24) (Fig. 4). De plus, nous avons pu obtenir un Nmax et un TTR (< 600 s) satisfaisants avec la combinaison des colorants.

Réactions avec différents colorants avant et après incubation à 67 °C pendant 30 min. Les tubes 1 à 8 ne contenaient que du bleu de bromothymol, montrant la couleur de la réaction avant l'ajout de l'échantillon. Les solutions d'échantillon contenaient soit du rouge de phénol, soit du rouge de crésol. Les tubes 9 à 16 représentent les tubes 1 à 8 après l'ajout de l'échantillon avec une solution contenant du rouge de phénol, et les tubes 17 à 24 sont après incubation à 67 ° C pendant 30 min. Les tubes 25 à 32 représentent les tubes 1 à 8 après l'ajout d'échantillon avec une solution contenant du rouge de crésol, et après une incubation de 67 ° C pendant 30 min, les résultats étaient les tubes 33 à 40. Les tubes 12, 16, 28 et 32 ​​étaient des témoins sans matrice. La concentration finale de colorants dans les tubes était la suivante : les tubes 1 à 4 contenaient 50 μM de bleu de bromothymol ; 5 à 8 contenaient 100 μM de bleu de bromothymol ; 9–12 et 17–20 contenaient 50 μM de bleu de bromothymol et 100 μM de rouge de phénol; 13–16 et 21–24 contenaient 100 μM de bleu de bromothymol et 100 μM de rouge de phénol; 25–28 et 33–36 contenaient 100 μM de bleu de bromothymol et 100 μM de rouge de crésol ; 29–32 et 37–40 contenaient 50 μM de bleu de bromothymol et 100 μM de rouge de crésol.

Nous n'avons observé aucune réaction faussement positive lors d'une amplification de 30 minutes.

Considérant que la réaction LAMP colorimétrique utilisée dans cet article dépend du pH, nous devons analyser si le pH de la solution d'échantillon pourrait interférer avec les paramètres de réaction tels que Nmax et TTR. Les solutions d'échantillons ont été testées à cinq pH différents allant de 7 à 9, avec une augmentation de 0,5. Sans aucun ajustement, la solution avait un pH d'environ 8,5, nous avons donc dû ajouter du NaOH ou du HCl pour atteindre le pH souhaité. Après avoir fait tourbillonner un échantillon d'écouvillon nasopharyngé dans la solution, nous avons vérifié que la couleur rose s'intensifiait, indiquant une certaine basification.

Toutes les réactions sont devenues positives lors du test avec des amorces de contrôle interne pour la rActine humaine (tableau S2), cependant, un pH plus élevé de la solution d'échantillon a provoqué une augmentation du TTR, comme prévu (tableau S3). Les solutions d'échantillons avec un pH de 7, 0 à 7, 5 ont montré une cohérence plus élevée entre les répétitions et des valeurs de TTR plus faibles (642 ± 54 et 714 ± 24 s, respectivement).

Les réactions colorimétriques qui reposent sur le changement de pH ne sont pas compatibles avec les solutions tampons et ne contiennent généralement que des résidus de tampons de stockage d'enzymes. Cependant, nous avons remarqué que lors de l'utilisation d'enzymes très concentrées (solutions mères à 120 U/μL), ayant donc un report de tampon plus faible, les réactions contenant du bleu de bromothymol s'acidifiaient rapidement. Environ 15 min dans la glace ont suffi à provoquer un changement visible de la couleur de réaction du bleu au verdâtre. Nous avons testé s'il existait une concentration optimale de Tris qui empêcherait le changement de couleur lors de la préparation des tubes sans interférer avec l'étape d'amplification. Nous avons analysé la valeur delta (Nmax) et le temps initial de l'amplification (Xt) obtenus dans chaque condition juste après la production du mélange réactionnel.

Il a été possible d'observer qu'avec l'augmentation de la concentration de Tris, le temps initial d'amplification augmentait également (Fig. S3). En raison de la caractéristique tampon du Tris entre la plage de pH de 6 à 8, le pH des réactions, et par conséquent sa couleur, était plus difficile à modifier car la concentration de Tris était plus élevée. La concentration de Tris et le Nmax étaient inversement proportionnels, une quantité plus élevée de Tris entraînait un delta inférieur (Nmax) de la couleur de réaction par rapport à la plus faible concentration de Tris testée (510 μM).

Il n'y avait pas de différence significative avec les différentes méthodes d'ajout de l'échantillon, c'est-à-dire que la présence de l'huile minérale n'était pas un problème lors de l'ajout de l'échantillon à la réaction. De plus, dans les conditions où 0 ou 5 μL d'huile minérale étaient ajoutés à la réaction, une évaporation se produisait toujours, car de petites gouttelettes pouvaient être observées dans le capuchon du microtube et le volume au fond du microtube diminuait (Fig. 5). Nous avons observé que sans l'huile minérale, il n'était pas possible d'obtenir une stabilisation du Nmax car l'évaporation se produisait pendant l'amplification, augmentant la saturation de la couleur capturée, conduisant à un Nmax plus élevé.

Effet de l'huile minérale après amplification à 67 °C pendant 60 min. Dans les tubes 1, 2 et 7, il n'y a pas eu d'addition d'huile minérale ; les tubes 3 et 4 ont reçu 5 μL d'huile minérale et les tubes 5, 6 et 8 ont reçu 10 μL d'huile minérale. Les tubes 1 à 6 ont reçu le contrôle positif du SARS-CoV-2 et les tubes 7 et 8 étaient les contrôles négatifs.

Le protocole final a été fixé à l'ajout de 12 μL d'huile minérale à une réaction de 20 μL, car aucune gouttelette n'a été observée dans le capuchon du microtube - le volume au fond du tube est resté le même pendant tout le test - et il était possible pour obtenir une stabilisation de la valeur Nmax. Nous n'avons pas observé de différence significative de TTR ou de sensibilité lorsque de l'huile minérale a été ajoutée à la réaction.

La limite a été établie à 5 équivalents génome par μL avec 100% de positivité (10/10) avec un Nmax moyen de 54 (± 26) et le temps initial d'amplification (Xt) d'environ 1302 s (± 396) (Fig. 6 et fig. S4). D'autres expériences simulant le transport et le stockage sont en cours d'exécution pour analyser si la sensibilité du test reste la même.

Limite de détection du test utilisant une solution témoin contenant les plasmides pUC57 clonés avec les séquences d'ADN synthétiques correspondant soit aux sites du gène N soit à Orf1ab. (A) Dans l'axe des x est la dilution de la solution de contrôle en copies par réaction en Log et l'axe des y est le Xt (temps initial d'amplification en secondes) des réactions. (B) Dans l'axe des x est la dilution de la solution de contrôle en copies par réaction et l'axe des y est le Nmax de la réaction.

Dans le tableau 2, nous résumons la composition optimisée du tampon de réaction et de la solution d'échantillon. Les échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé peuvent être inactivés par la chaleur à 95 ° C pendant 10 min ou ajoutés à la réaction sans aucun traitement. Après l'ajout de l'échantillon, l'amplification doit être effectuée à 67 ° C pendant 30 min.

Les réactions colorimétriques RT-LAMP ont révolutionné les tests POCT moléculaires, permettant une instrumentation bon marché avec une sensibilité et une spécificité élevées, caractéristiques des tests moléculaires comme la qPCR9. Bien qu'elles soient couramment utilisées en raison de leur différenciation facile entre les réactions négatives et positives par observation à l'œil nu, les réactions colorimétriques permettent également la substitution de fluorophores coûteux et instables et de configurations de filtres pour des systèmes d'acquisition de données plus simples. Dans notre étude, nous avons utilisé le dispositif Hilab® Molecular, qui comprend une détection RVB couplée à des LED blanches et une connectivité Internet via WiFi ou USB, offrant un suivi simultané de la réaction et une évaluation à distance du test par des professionnels de la santé. Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle formulation optimisée pour l'analyse des tests POCT à distance, à l'aide du dispositif Hilab® Molecular.

La quantification du matériel génétique amplifié par les réactions qPCR peut être mesurée par des cycles de température, où la quantité d'ADN est doublée à chaque cycle, ce qui facilite l'interprétation de la progression de la réaction et l'estimation de la charge initiale de l'échantillon. D'autre part, les réactions RT-LAMP se produisent à une seule température et ont une cinétique complexe par rapport à la qPCR. Cependant, les réactions LAMP colorimétriques peuvent être décrites comme des paramètres tels que le temps de réaction (TTR), le temps initial d'amplification (Xt) et le changement de couleur maximal (Nmax). Néanmoins, nous avons montré que ces paramètres sont toujours utiles pour la modélisation empirique d'une mesure quantitative du taux d'amplification à l'aide de DoE. Des conditions acceptables ont été obtenues pour cinq variables continues et deux variables catégorielles, avec environ 200 conditions de test non reproduites. Même avec l'élimination des valeurs aberrantes, les modèles obtenus étaient acceptables et ont été utilisés avec succès pour obtenir des conditions optimisées pour nos conditions d'essai spécifiques.

Parmi tous les paramètres testés, nous avons observé que la séquence d'amorce - visant le gène N, ORF1ab ou E -, les concentrations de Bst, d'amorce et de sulfate de magnésium étaient les plus significatives (α = 0,05). Ceci est cohérent avec d'autres articles qui ont testé l'optimisation des composants, qui ont également constaté que l'augmentation de la concentration en enzyme et en MgSO410,11 améliorait les performances de la réaction. Dans notre cas, la meilleure concentration était de 0,4 U/μL de Bst et 8 mM de MgSO4. Le mélange maître WarmStart de l'ONÉ pour le SRAS-CoV-2 (qui contient la Bst ADN polymérase 2.0) recommande une plage de Tris de 0,5 et 5 mM12, nous avons constaté que la plus faible concentration de Tris pouvant être atteinte (510 μM) donne une plus faible TTR. Ceci est en accord avec les caractéristiques de tampon du Tris puisque la réaction doit être faiblement tamponnée pour permettre le changement de couleur du colorant dépendant du pH. Ils recommandent également que le pH du mélange maître soit compris entre 7,5 et 9,0. Nous avons testé la concentration de KOH pour définir un pH initial de la réaction qui donne un TTR plus faible et un Nmax plus élevé. Nous avons vu que les concentrations de KOH testées n'avaient pas de différence statistiquement significative dans le TTR ou Nmax, bien qu'une concentration finale de 1,2 mM ait donné un décalage de couleur légèrement meilleur (Nmax). Nous avons également abordé l'ajustement du pH de la solution d'échantillon en mesurant le TTR et le Nmax de la réaction juste après sa préparation et par la diminution de son pH au fil du temps. Une solution d'échantillon avec un pH compris entre 7 et 7,5 montre un TTR inférieur de la réaction et a une meilleure stabilisation du pH pendant le stockage. En outre, un pH plus élevé a démontré une réduction significative du pH pendant quelques semaines de stockage (données non présentées).

Il a été démontré que le chlorhydrate de guanidine pH 8,0 améliore la réaction LAMP13. Nous avons observé que l'ajustement du pH de Gu-HCl à 8,0 n'avait pas d'impact significatif sur le TTR ou le Nmax de la réaction. De plus, le pH du Gu-HCl a diminué avec le temps, ce qui est incompatible avec un stockage de longue durée, et un ajustement juste avant utilisation est incongru avec un test POC. Un autre additif testé était la bétaïne qui a été utilisée dans les techniques PCR et LAMP pour améliorer la spécificité du test14,15. En utilisant une concentration de bétaïne de 400 mM, nous n'avons pas observé d'amplification non spécifique, contrairement à ce qui a été observé dans une autre étude15.

Une combinaison de colorants dans le mélange réactionnel a déjà été testée pour étendre l'application de LAMP8 colorimétrique, cependant, ici, nous utilisons la combinaison de différents colorants comme contrôle du pipetage pour garantir que l'opérateur a ajouté l'échantillon au tube de réaction, empêchant ainsi les fausses négatifs par manque d'ajout d'échantillon. La solution d'échantillon contient du rouge de phénol et après l'ajout de l'échantillon dans le mélange réactionnel - qui contient du bleu de bromothymol - la couleur vire au violet. Le contrôle de la qualité des tests effectués à distance est de la plus haute importance, en particulier dans le cas du diagnostic moléculaire. L'inclusion du colorant dans le tampon d'échantillon ne semble pas affecter l'efficacité du traitement de l'échantillon et est peu susceptible d'affecter l'inactivation par la chaleur. Parmi les huit colorants testés, nous avons choisi le colorant bleu de bromothymol pour composer le mélange réactionnel et le colorant rouge de phénol pour la solution échantillon. L'inverse (rouge de phénol dans le mélange réactionnel et bleu de bromothymol dans la solution d'échantillon) n'a pas été approuvé car la solution d'échantillon deviendrait plus sombre et peu attrayante en tant que produit de diagnostic. Les deux colorants étaient stables, avec une plage de pH compatible avec notre réaction et le changement de couleur était mieux détecté dans le système RVB. En outre, ces deux colorants ont été largement utilisés dans les réactions LAMP colorimétriques4,8,16,17.

L'appareil Hilab® Molecular ne comporte pas de couvercle chauffant pour faciliter la production et augmenter la robustesse en réduisant le nombre de pièces mobiles. Ceci, cependant, rend les réactions sensibles à une évaporation excessive, conduisant à une éventuelle mauvaise interprétation des réactions colorimétriques causées par l'augmentation de la saturation des couleurs. Pour atténuer ce problème, l'huile minérale pour PCR a été testée pour empêcher l'évaporation18. Nous avons constaté que l'ajout d'huile peut complètement inhiber l'évaporation et stabiliser la couleur, sans effets néfastes sur le signal ou le temps de réaction. La présence d'huile minérale n'a pas affecté le processus de transfert d'échantillon, qu'elle ait été ajoutée sur ou sous la couche d'huile minérale. L'homogénéisation de la solution avec une pipette, ou en frappant sur les parois du tube, n'affecte pas non plus l'efficacité de la réaction. La couche d'huile s'est rétablie après quelques secondes. L'huile minérale peut être ajoutée au préalable et la réaction peut être congelée avec l'huile. De plus, l'huile permet d'effectuer la réaction dans des conditions plus simples, par exemple dans un bloc sec.

La limite de détection (LoD) atteinte était de 5 copies par μL avec 100 % de positivité en utilisant un contrôle synthétique, similaire à d'autres tests RT-LAMP19. Les expériences précédentes réalisées dans notre laboratoire à l'aide du mélange maître WarmStart Colorimetric LAMP 2X de l'ONÉ avec des amorces ciblant les gènes N et E du SRAS-CoV-2 n'ont pas pu atteindre une limite de détection inférieure à 50 copies par μL (données non présentées). La limite de détection des tests RT-PCR utilisant des échantillons purifiés varie entre 0,0819 et 1420 copies par μL21,22,23. En comparant notre LoD avec d'autres tests moléculaires utilisant un écouvillon direct, notre limite de détection était de 25 000 copies par ml alors que la LoD des tests commerciaux était de 60 000 à 540 000 NDU par ml24—les copies d'ARN viral/ml équivaut aux équivalents de copie du génome/ml ( GCE/mL) ou unités détectables d'acide nucléique/mL (NDU/mL)25. Les résultats obtenus n'ont pas été comparés avec le test RT-qPCR car notre technique utilise des échantillons non purifiés.

Des tests de stabilité doivent encore être exécutés pour vérifier si la LoD reste la même après une longue période de stockage. La validation clinique du test à l'aide d'échantillons de patients positifs pour COVID-19 est également requise.

Il est important de garder à l'esprit que les résultats trouvés ici ont été obtenus en utilisant 4 μL de solution d'échantillon pour un volume de réaction final de 20 μL. Les résultats peuvent être différents si la proportion d'échantillon ajoutée ou la composition de la solution d'échantillon change. De plus, bien que l'augmentation du volume total de la réaction puisse améliorer la sensibilité26, cela peut augmenter le coût du test.

Ici, nous avons réussi à optimiser les conditions de réaction pour la détection colorimétrique des acides nucléiques dans les paramètres POCT, avec une sensibilité dix fois plus élevée par rapport au mélange maître WarmStart Colorimetric LAMP de NEB. Notre recette de mélange principal peut maximiser les différences de signal de couleur, minimiser le temps d'amplification des séquences cibles, contrôler l'ajout d'échantillon et peut être utilisée dans un environnement réfrigéré. Il est également capable d'accueillir des temps de réaction plus longs sans évaporation du volume, même sans l'utilisation d'un couvercle chauffant, grâce à l'ajout d'huile minérale. L'amplification non spécifique a également été atténuée par l'optimisation de la méthodologie de surface de réponse (RSM). Ces améliorations permettront des tests de dépistage plus rentables dans un large éventail de configurations possibles.

Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase (M0538), Antarctic Thermolabile UDG (M0372), WarmStart® RTx Reverse Transcriptase (M0380), ainsi que des dNTP (N0446S et N0459S) ont été acquis auprès de New England Biolabs (NEB). Rouge de phénol (114529), huile minérale (M5904), chlorure de potassium (P9541), hydroxyde de potassium (P5958), sulfate de magnésium (M3409), Tween-20 (P9416), chlorhydrate de guanidine (G3272), chlorhydrate de tris (93363) et La bétaïne (B0300) a été acquise auprès de Sigma-Aldrich. L'eau ultrapure de type I (10977) et le tampon TE pH 8,0 (93283) ont été acquis auprès d'Invitrogen. Les colorants bleu de bromothymol (AB08416RA), rouge de crésol (VC09256RA), rouge de chlorophénol (VC06226RA), violet de bromocrésol (PB06593RA), violet de métacrésol (PM06383RA), α-naphtolphtaléine (AN07911RA) et O-crésolphtaléine (C05368RA) ont été acquis auprès d'Êxodo Científica .

Les séquences d'amorces utilisées ciblaient le gène N, les gènes E13 ou la séquence Orf1ab27 du SARS-CoV-2. Un ensemble d'amorces ciblant la séquence d'ARNm de l'ACTB humain a été utilisé comme contrôle interne (tableau S2). Les amorces ont été commandées auprès d'Exxtend avec purification HPLC et remises en suspension à 200 μM dans de l'eau ultra-pure sans nucléase de type 1. Pour faciliter le pipetage, les amorces ont été préparées sous la forme d'un mélange d'amorces concentrées au 10ème. Le mélange d'amorces de contrôle interne était constitué uniquement d'amorces ACTB, tandis que le mélange d'amorces SARS-CoV-2 était composé d'une combinaison de deux ensembles d'amorces ciblant soit les gènes N et E, les gènes N et Orf1ab, soit les gènes E et Orf1ab. Chaque mélange contenait des amorces FIP et BIP de 16 µM, des amorces F3 et B3 de 2 µM et des amorces de boucle de 4 µM pour chaque cible utilisée.

Des contrôles positifs lyophilisés ont été obtenus auprès de GenScript et consistaient en des plasmides pUC57 clonés dans le site EcoRV avec la séquence du gène N, du gène E ou d'Orf1ab du SARS-CoV-2 (tableau S2). Les contrôles positifs ont été dilués avec de l'eau ultra-pure sans nucléase de type 1 à une concentration intermédiaire, puis mélangés avec une solution d'échantillon (décrite ci-dessous) pour obtenir une concentration finale de 106 copies/μL de chaque cible.

La solution d'échantillon, sauf indication contraire, consistait en 10 % de tampon TE pH 8,0 (Tris 10 mM et EDTA 1 mM), 0,1 % de Tween-20 et 500 μM de rouge de phénol. La solution d'échantillon a été ajoutée à la réaction dans un volume de 4 μL pour obtenir une concentration finale de 100 μM du colorant colorimétrique.

Dans les expériences où nous avons utilisé des amorces ciblant l'ARNm de l'ACTB, des échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé (NP) de volontaires asymptomatiques ont été collectés par du personnel qualifié. Les échantillons collectés ont ensuite été tourbillonnés dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml contenant 500 μl de solution d'échantillon et inactivés thermiquement à 95 ° C pendant 10 min. Tous les échantillons utilisés dans cette étude ont été obtenus sous la signature de conditions de consentement libre et clarifiées.

Les réactions RT-LAMP ont été réalisées, sauf indication contraire, avec une concentration finale d'amorces FIP et BIP de 1, 6 µM, d'amorces F3 et B3 de 0, 2 µM et d'amorces de boucle de 0, 4 µM de chaque gène cible. Étaient également présents 1,4 mM de dNTP (1,4 mM dATP, dCTP, dGTP et 0,7 mM dTTP, dUTP), 0,4 U/μL de Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase, 0,3 U/μL de WarmStart® RTx Reverse Transcriptase, 0,005 U/μL Antarctic UDG thermolabile, 400 mM de bétaïne, 40 mM de chlorhydrate de guanidine pH 8,0, 10 mM de KCl, 8 mM de MgSO4, 0,1 % (v/v) de Tween-20, 100 μM de bleu de bromothymol et 4 μL de la solution d'échantillon, avec un total réaction de 20 μL.

Le protocole de réaction testé a été fixé à 67°C pendant 30 min, sauf indication contraire. Étant donné que la réaction comprend deux indicateurs de pH - le bleu de bromothymol et le rouge de phénol - la lecture d'un résultat positif ou négatif a été prise par le changement de couleur dans les tubes. Dans le cas d'une réaction positive, la couleur initiale est passée du violet au jaune par la diminution du pH de la réaction, provoquée par la libération de protons lorsque les dNTP ont été incorporés dans le brin d'ADN nouvellement synthétisé.

Pour déterminer les paramètres optimaux pour notre formulation RT-LAMP personnalisée, une approche de conception d'expériences a été adoptée. Nous avons choisi une méthodologie de surface de réponse (RSM), pour affiner la valeur de cinq facteurs continus (ADN polymérase, sulfate de magnésium, amorces et concentrations de bétaïne, ainsi que la température de réaction) et deux facteurs catégoriels (ajustement du pH du chlorhydrate de guanidine [ oui/non], et combinaison de séquences d'amorces [N/E, N/Orf1ab ou E/Orf1ab]). Les niveaux élevés et bas de bétaïne et de sulfate de magnésium ont été modélisés sous forme de concentrations millimolaires, tandis que les concentrations d'amorces ont été modélisées sous forme de fractions de la recette standard. Les concentrations de polymérase ont été modélisées sous forme de fractions à partir d'une concentration maximale de 0,8 U/μL. Les niveaux de réaction haut et bas de la température ont été fixés à + 2 ° ou - 2 ° par rapport à la température d'origine de 65 ° C.

Minitab 19 a été utilisé pour générer la matrice expérimentale, randomiser l'ordre d'exécution et analyser les données. Pour chaque condition, nous avons utilisé une réaction positive (1 × 106 équivalents génomes/réaction) et une réaction témoin négative pour mesurer l'efficacité de la réaction et les taux d'amplification non spécifiques pour chaque condition. Les facteurs de réponse analysés étaient le temps de réaction (TTR), Nmax et le temps initial d'amplification (Xt) pour les réactions positives et négatives.

Sur la base de la littérature publiée28,29, nous avons testé d'autres colorants indicateurs de pH tels que le bleu de bromothymol, le rouge de phénol, le rouge de crésol, le rouge de chlorophénol, le violet de bromocrésol, le violet de métacrésol, l'α-naphtolphtaléine et l'O-crésolphtaléine à des concentrations finales allant de 50 à 200 μM. . Des solutions mères ont été préparées sous forme de 2 mM de colorant dans du tampon TE 1 mM et diluées à la concentration souhaitée avec de l'eau ultrapure sans nucléase de type I. Les gradients de pH ont été obtenus en mélangeant les colorants colorimétriques avec du NaOH 1 M ou du HCl.

Étant donné que notre test RT-LAMP dépend du pH, nous avons émis l'hypothèse que le pH initial de la solution pourrait affecter le TTR ou le Nmax de la réaction. Pour vérifier cela, nous avons testé le pH initial optimal de la réaction, en l'ajustant avec 10 mM de KOH à une concentration finale de 0,4 à 1,6 mM de KOH. Les tubes contenaient des amorces ciblant les gènes N et Orf1ab et des contrôles positifs comme décrit ci-dessus.

Nous avons testé une combinaison de bleu de bromothymol avec du rouge de crésol et du rouge de phénol à des concentrations finales allant de 50 à 200 μM, dans les solutions d'échantillon et de réaction. Un écouvillon nasopharyngé recueilli a été utilisé comme échantillon et les réactions avaient des amorces ciblant l'ARNm d'ACTB. Les contrôles non-matrices ont été constitués uniquement par la solution d'échantillon. Le colorant a été sélectionné en fonction du changement de couleur après l'ajout de l'échantillon à la réaction LAMP et à la fin de la réaction positive.

Nous avons préparé des solutions d'échantillons à des pH allant de 7 à 9 avec une augmentation de 0,5 entre les conditions. Chaque condition de pH avait 1 tube comme contrôle négatif et un triple exemplaire technique avec des échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé. Les tubes contenaient des amorces ciblant l'ARNm d'ACTB.

Puisque notre protocole était basé sur le changement de la réaction de pH, nous avons testé la concentration idéale de Tris dans la réaction finale. Les enzymes utilisées dans la réaction LAMP et les réactifs de la solution d'échantillon contenaient du Tris dans leurs compositions, de sorte que la concentration minimale de Tris pouvant être obtenue dans la réaction était de 510 μM - la concentration la plus faible testée - et la plus élevée étant de 1000 μM (NEB affirme que le mélange maître Warmstart® RT-LAMP fonctionne avec jusqu'à 1000 μM de Tris). Différents volumes de tampon Tris 10 mM ont été ajoutés à chaque réaction pour atteindre les concentrations finales testées. Les tubes contenaient des amorces ciblant les gènes N et Orf1ab et un contrôle positif dilué (1000 copies génomiques/réaction) a été utilisé pour vérifier l'effet du tampon Tris tout en simulant des échantillons à faible charge virale.

Comme le système Molecular Hilab® ne comporte pas de couvercle chauffant, une évaporation de la solution se produit, ce qui peut affecter l'efficacité de la réaction et l'acquisition des données de couleur. Pour éviter ce problème, nous avons testé l'ajout de 0 à 15 μL par réaction d'huile minérale. Nous avons également testé si la présence de l'huile minérale pouvait d'une manière ou d'une autre entraver l'ajout de l'échantillon dans le mélange réactionnel, en ajoutant l'échantillon à travers, au-dessus et au fond de l'huile, en faisant intentionnellement des bulles dans le tube. Les tubes contenaient des amorces ciblant les gènes N et Orf1ab et des contrôles positifs ont été utilisés comme décrit précédemment.

Pour vérifier la limite de détection de la réaction RT-LAMP, nous avons utilisé des contrôles positifs à des concentrations allant de 10 à 10 000 équivalents de génome par réaction. Chaque point de dilution a été réalisé en 10 répétitions techniques. Les contrôles ont été dilués dans la solution d'échantillon et les réactions ont été réalisées à 67 °C pendant 30 min dans le dispositif Hilab® Molecular comme décrit précédemment. Nous avons établi la LoD comme la dilution maximale où il était possible d'obtenir 100% de positivité, c'est-à-dire l'amplification des cibles.

Pour quantifier les résultats de chaque condition optimisée, un logiciel développé en interne a été utilisé. Le logiciel était capable de reconnaître une feuille de tableau de couleurs hexadécimales et de construire un graphique basé sur le changement de couleur de la réaction. Une fois le graphique construit, l'opérateur pouvait définir manuellement l'heure initiale de l'amplification (Xt), de sorte que le logiciel procédait à une suppression de l'arrière-plan et construisait une courbe sigmoïde à l'aide d'une régression polynomiale à 4 paramètres des données. Le logiciel a également renvoyé trois paramètres pour chaque tube : Nmax, qui est la valeur delta de la courbe d'amplification, TTR, qui est le temps nécessaire pour atteindre 50 % du delta d'amplification, et R, qui est lié à l'efficacité de la réaction et représente la vitesse à laquelle la réaction atteint le plateau. Nous avons également analysé le temps initial d'amplification (Xt) dans certains cas. Ces paramètres ont été calculés pour chaque test rapporté ici et ont été utilisés pour décider quelle condition serait la meilleure pour chaque expérience.

Le système Molecular Hilab® a été utilisé pour suivre à distance les réactions colorimétriques. L'appareil est composé d'un thermobloc et d'un capteur RVB, pouvant inactiver à chaud et refroidir les échantillons, maintenir la réaction à une température optimale et détecter l'insertion des tubes de réaction. L'insertion des tubes dans l'appareil ainsi que la manipulation des échantillons sont effectuées manuellement par l'opérateur. Les données de réaction sont envoyées sous la forme d'une série chronologique de couleurs. Après la collecte des données, deux images sont générées : une image avec le changement progressif de la couleur de la réaction jusqu'à la fin de la réaction, et un graphique construit à partir de la série de changement de couleur, avec les courbes de chaque tube au fil du temps. Avec l'appareil, il est possible d'analyser la couleur des tubes de réaction avec plus de précision et de robustesse qu'à l'œil nu, par exemple. Ces images ainsi que le questionnaire d'anamnèse sont pris en compte pour donner le résultat final du test par des professionnels biomédicaux en 1 min.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant, Raddatz, WB, sur demande raisonnable.

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Bruna Winkert Raddatz, Edson Yu Sin Kim, Louise Matthew Imamura, Gisleine Jarenko Steil, Erika Bergamo James, James Peter Timm Soares, Victor Henrique Alves Ribeiro, Bernardo Montesanti Machado de Almeida, Sergio Renato Rogal Jr. & Marcus Vinicius Mazega Figueredo

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Acquisition de financement : BMMA, MMF ; Conservation des données : LMI, EYSK, BWR ; Enquête : BWR, LMI, EYSK, GJS ; Méthodologie : LMI, EYSK, BWR ; Administration du projet : BWR, BMMA, EBS, SRRJ, MMF ; Supervision : BWR, BMMA, EBS, SRRJ, MMF ; Rédaction—ébauche originale : BWR, EYSK, LMI ; Rédaction—révision et édition : BWR, LMI, EYSK ; Développement de logiciels d'analyse LAMP : SPTS et VHAR

Correspondance à Bruna Winkert Raddatz.

Les auteurs déclarent les intérêts financiers/relations personnelles suivants qui peuvent être considérés comme des intérêts concurrents potentiels : MVM Figueredo est le PDG de Hi Technologies LTDA ; SR Rogal Júnior est le directeur technique de Hi Technologies LTDA ; BMM Almeida est CMO chez Hi Technologies LTDA ; D'autres auteurs travaillent ou ont travaillé chez Hi Technologies LTDA. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Raddatz, BW, Kim, EYS, Imamura, LM et al. Développement d'une RT-LAMP colorimétrique optimisée pour le test SARS-CoV-2 avec des contrôles de procédure améliorés pour les diagnostics à distance. Sci Rep 12, 21424 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

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Reçu : 13 septembre 2022

Accepté : 06 décembre 2022

Publié: 11 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

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