Le contexte communautaire et la pCO2 impactent le transcriptome de la bactérie « helper » Alteromonas in co

Apr 10, 2023

ISME Communications volume 2, Numéro d'article : 113 (2022) Citer cet article

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De nombreux photoautotrophes microbiens dépendent de bactéries hétérotrophes pour accomplir des fonctions essentielles. Cependant, les changements environnementaux pourraient modifier ou éliminer ces interactions. Nous avons étudié les effets de la modification de pCO2 sur la transcription génique dans des co-cultures de 3 souches de picocyanobactéries (Synechococcus souches CC9311 et WH8102 et Prochlorococcus souche MIT9312) jumelées avec la bactérie 'helper' Alteromonas macleodii EZ55. La co-culture avec des cyanobactéries a entraîné un nombre beaucoup plus élevé de gènes régulés positivement et négativement dans EZ55 que pCO2 seul. L'analyse des voies a révélé une transcription significativement différente des gènes impliqués dans le métabolisme des glucides, la réponse au stress et la chimiotaxie, avec différents modèles de régulation à la hausse ou à la baisse dans la co-culture avec différentes souches de cyanobactéries. Les modèles de transcription génique des transporteurs de nutriments organiques et inorganiques et des gènes de catabolisme dans EZ55 suggèrent que les ressources disponibles dans les milieux de culture ont été modifiées dans des conditions de pCO2 élevées (800 ppm). Dans l'ensemble, l'évolution des modèles de transcription était cohérente avec la possibilité que la composition des excrétions de cyanobactéries ait changé sous les deux régimes de pCO2, provoquant des changements écophysiologiques importants chez les deux membres des co-cultures. De plus, une régulation négative significative des gènes de stress oxydatif dans les cocultures MIT9312/EZ55 à 800 ppm de pCO2 était cohérente avec un lien entre la disponibilité réduite prévue des sous-produits photorespiratoires (c.-à-d. glycolate/2PG) dans cette condition et les réductions observées des charges de stress oxydatif interne pour EZ55. , fournissant une explication possible du manque "d'aide" précédemment observé fourni par EZ55 à MIT9312 sous pCO2 élevé. Si de vastes altérations similaires de l'écophysiologie microbienne se produisent dans l'océan à mesure que la pCO2 atmosphérique augmente, elles pourraient entraîner une modification substantielle du fonctionnement de l'écosystème et de la composition de la communauté.

Poussée en grande partie par les activités anthropiques, la teneur en dioxyde de carbone de l'atmosphère terrestre (pCO2) augmente à un rythme sans précédent dans l'histoire [1]. L'un des impacts de ce changement est l'acidification des océans causée par l'absorption de CO2 par l'eau de mer [2]. Les taux de ces changements sont influencés par le phytoplancton marin, qui est responsable d'environ la moitié de la productivité primaire mondiale [3, 4]. Le phytoplancton est à son tour interconnecté métaboliquement avec le bactérioplancton via la libération de matière organique dissoute (DOM) qui est reminéralisée via la respiration aérobie, créant un cycle interne du carbone appelé boucle microbienne [5]. Les taux relatifs de fixation et de libération du carbone, ainsi que l'exportation de carbone vers les sédiments ou les niveaux trophiques supérieurs, influencent le rythme global du changement de pCO2 [6]. En conséquence, des efforts substantiels ont été déployés pour comprendre comment le changement de pCO2 affectera la dynamique de croissance du phytoplancton [7, 8].

Les picocyanobactéries Prochlorococcus et Synechococcus sont les deux genres de phytoplancton les plus abondants en haute mer et sont donc des composants importants du cycle du carbone marin [9]. Les modèles de changement climatique ne considérant que l'augmentation de la température et de la lumière ont prédit des augmentations significatives du nombre de cellules pour les deux taxons d'ici l'an 2100 [9]. Cependant, les deux genres ont réagi différemment dans les expériences basées sur la culture au futur pCO2 et à la température [10], avec Prochlorococcus montrant des taux de croissance considérablement réduits sous l'année projetée 2100 pCO2 (800 ppm) [11]. Les modèles incorporant la réponse du phytoplancton à la fois à la température et au pCO2 ont suggéré que Prochlorococcus serait supplanté dans toute son aire de répartition par Synechococcus [12] avec des impacts potentiellement dramatiques sur le cycle du carbone océanique.

Fait intéressant, l'altération de la croissance de Prochlorococcus à pCO2 élevé a été partiellement causée par des changements de transcription dans la bactérie « auxiliaire » Alteromonas macleodii EZ55 avec laquelle elle a été co-cultivée dans ces expériences [7]. Des expériences antérieures ont montré que les cultures de Prochlorococcus dépendaient de bactéries auxiliaires comme EZ55 pour tolérer le H2O2 trouvé dans les milieux de culture [13, 14]. Cependant, EZ55 a régulé négativement l'enzyme catalase éliminant H2O2 à 800 ppm de pCO2, retenant efficacement l'aide de Prochlorococcus et entraînant des taux de croissance réduits et une mortalité élevée [7].

L'interaction auxiliaire entre EZ55 et Prochlorococcus ne représente qu'un des nombreux échanges similaires entre microbes marins. Par exemple, de nombreuses interactions "Black Queen" (BQ) impliquant des fonctions biologiques qui fuient dont les produits sont disponibles pour d'autres membres de la communauté [15, 16] créent des incitations évolutives pour que les microbes deviennent dépendants les uns des autres grâce à la rationalisation métabolique. Les résultats évolutifs du BQ vont de la diminution de l'expression génique [17] à la perte de gènes [14, 16] et produisent des organismes "bénéficiaires" tels que Prochlorococcus qui dépendent d'organismes "auxiliaires" comme Alteromonas pour effectuer des fonctions qui fuient [14, 18, 19]. Étant donné que l'une de ces interactions peut être perturbée par une pCO2 élevée de la même manière que celle observée entre Prochlorococcus et EZ55, il est possible que le cycle du carbone dans les futurs océans subisse des changements difficiles à prévoir en fonction du comportement des cultures axéniques.

Notre capacité à évaluer l'impact du futur pCO2 sur les communautés marines est donc limitée par la complexité écologique réduite des expériences en laboratoire [2], et en particulier les expériences sur les microalgues utilisant des cultures axéniques peuvent déformer la dynamique naturelle des communautés marines [20]. Par conséquent, les études utilisant des communautés simplifiées comprenant différents groupes fonctionnels de phytoplancton et de bactéries hétérotrophes fournissent une approche plus réaliste pour comprendre comment la dynamique du cycle du carbone sera affectée par le changement global. Ici, nous avons exploré l'impact de l'année projetée 2100 pCO2 (800 ppm) sur la transcription dans des co-cultures d'Alteromonas sp. EZ55 avec la picocyanobactérie Prochlorococcus MIT9312, Synechococcus sp. CC9311 et Synechococcus sp. WH8102. Notre objectif était à la fois de comprendre comment ces organismes réagissent au changement de pCO2 ainsi que comment EZ55 réagit à la présence de différents partenaires cyanobactériens. Nos résultats ont démontré que la pCO2 de l'année 2100 aura probablement un impact sur les conversations métaboliques entre les cyanobactéries et les bactéries marines en modifiant la disponibilité des métabolites sécrétés et des nutriments inorganiques, avec des effets secondaires sur la physiologie du stress, qui ont tous un impact sur la fonction écologique de la communauté.

Six clones de la souche WH8102 de Synechococcus en haute mer et de la souche côtière de Synechococcus CC9311 ont été obtenus par dilution jusqu'à extinction dans un milieu SN [21]. Les cultures parentales de chaque organisme ont été obtenues auprès du National Center for Marine Algae (Boothbay Harbor, Maine) et étaient axéniques à la réception. Six clones d'Alteromonas sp. les souches EZ55 et Prochlorococcus MIT9312 ont également été préalablement obtenues et cryoconservées à -80 °C [7]. Les clones EZ55 utilisés dans nos co-cultures de Synechococcus étaient les mêmes 6 clones utilisés dans notre précédente étude transcriptomique de MIT9312 [7] afin de maximiser la comparabilité des résultats entre cette étude et la présente étude. Les co-cultures ont été initiées en mélangeant chacun des six clones de CC9311 et WH8102 avec l'un des clones EZ55.

Les cultures de Synechococcus ont été cultivées dans des conditions similaires à celles décrites dans notre expérience précédente avec Prochlorococcus [7]. En bref, toutes les cultures ont été préparées dans des tubes à centrifuger en verre à fond conique lavés à l'acide contenant 13 ml d'eau de mer artificielle (ASW) modifiée avec des stocks de nutriments [21] et avec de l'acide et/ou une base pour contrôler le pCO2. ASW (par L : 28,41 g NaCl, 0,79 g KCl, 1,58 g CaCl2*2H2O, 7,21 g MgSO4*7H2O, 5,18 g MgCl2*6H2O) a été stérilisé dans des bouteilles en verre lavées à l'acide, modifiées avec 2,325 mM (concentration finale) de filtre -bicarbonate de sodium stérilisé, puis barbotage d'air stérile pendant une nuit. Les cultures de Synechococcus ont été cultivées dans du SEv (par L : 32 μM de NaNO3, 2 μM de NaH2PO4, 20 μL de stock de métaux traces SN et 20 μL de stock de vitamines F/2). Les principales différences entre ce milieu et le milieu PEv utilisé dans notre précédente étude Prochlorococcus sont la source d'azote (NO3− vs NH4+, avec une concentration molaire de N et des rapports N:P identiques à PEv) et l'ajout de vitamines F/2 [ 21]. La chimie du carbonate de chaque lot de milieu a été déterminée avant les manipulations de pCO2 en mesurant l'alcalinité et le pH par titrage et colorimétrie, respectivement [7, 11], puis en utilisant la fonction oa dans le package seacarb dans R pour déterminer la quantité d'acide chlorhydrique et de bicarbonate (pour 800 ppm pCO2) ou de l'hydroxyde de sodium (pour 400 ppm pCO2) était nécessaire pour atteindre les conditions expérimentales souhaitées [22]. Des amendements acides et basiques ont été introduits immédiatement avant l'inoculation. Les cultures ont été cultivées dans une chambre de croissance Percival à 21 ° C sous 150 μmol de photons m -2 s -1 sur un cycle lumière: obscurité de 14:10. Les cultures de Synechococcus ont été cultivées sur une roue de culture tissulaire rotative à environ 60 tr/min.

Les transcriptomes des six répliques clonales de chaque souche de Synechococcus ainsi que leurs partenaires EZ55 ont été évalués à environ 400 (basé sur le pCO2 atmosphérique mesuré à Mauna Loa en 2015, lorsque l'expérience était prévue) ou 800 ppm (c'est-à-dire, l'année 2100 approximative prévue pCO2 selon le scénario GIEC A2) pCO2. Avant l'extraction de l'ARN, chaque culture a été acclimatée aux conditions expérimentales pendant trois cycles de transfert (environ 14 générations). La croissance a été suivie par cytométrie en flux à l'aide d'un cytomètre en flux Guava HT1 (Luminex Corporation, Austin, TX). Les concentrations de cellules EZ55 ont été déterminées par dilution sur gélose YTSS (par L, 4 g de tryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 15 g de sels marins, 15 g de gélose). Chaque fois que les densités de cellules de Synechococcus atteignaient 2,6 × 105 cellules mL-1, les cultures étaient diluées 26 fois dans du milieu frais. Des expériences préliminaires ont révélé que cette concentration cellulaire était suffisamment faible pour que la croissance ne soit pas limitée par les nutriments et que le pH et le pCO2 ne soient pas significativement affectés par les mécanismes de concentration du carbone des cyanobactéries. Dans le cycle de transfert final, chaque culture a été divisée en 5 sous-cultures identiques pour augmenter la biomasse disponible pour l'extraction d'ARN ; les 5 sous-cultures de chaque clone ont ensuite été regroupées et collectées sur un seul filtre en polycarbonate de 0, 2 μm par filtration douce à la seringue, puis congelées rapidement dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C avant l'extraction de l'ARN. Pour les cultures WH8102, une moyenne de 4,04 × 107 cellules WH8102 et 3,91 × 108 cellules EZ55 ont été collectées par filtre, et pour les cultures CC9311, une moyenne de 5,47 × 107 cellules CC9311 et 7,33 × 108 cellules EZ55 ont été collectées par filtre. Les paramètres chimiques de carbonate pour les cultures sont présentés dans le tableau 1.

Les taux de croissance malthusiens et exponentiels, les durées de latence et la mortalité post-transfert des cyanobactéries ont été calculés comme décrit précédemment [7]. L'effet de pCO2 sur ces propriétés a été analysé à l'aide de modèles linéaires à effets mixtes dans R à l'aide du package lme4, suivis de contrastes post-hoc à l'aide d'emmeans.

L'extraction de l'ARN a été réalisée séparément pour chaque culture répliquée avec le RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) avec une petite modification de l'étape de lyse [7]. L'ARNr a été éliminé avec le kit de suppression d'ARNr Ribo-Zero pour bactéries (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis) [7]. Après l'élimination de l'ARNr, les échantillons ont été purifiés et concentrés avec un kit de nettoyage RNeasy MiniElute (Qiagen). La quantité et la qualité de l'ARN post-digestion ont été évaluées avec un bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA). La préparation de la bibliothèque d'ARNm pour le séquençage par paires Illumina Hi-seq 2500 (PE100) a utilisé le kit de préparation d'échantillons d'ARN TruSeq v2 (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis). La longueur du fragment d'ADN était de 100 pb, les extrémités appariées ne se chevauchaient pas et la taille de l'insert était d'environ 300 pb. Des séquences de codes-barres individuelles ont été ajoutées aux lectures de séquences pour le séquençage multiplex qui ont été exécutées sur une seule voie au Sulzberger Columbia University Genome Center (CUGC) (New York, NY, États-Unis). Nos fichiers de séquences sont accessibles depuis le NCBI (BioProject PRJNA377729, numéros d'accès SRA SRX2619948-SRX2619957, SRX3033334-SRX3033345 et SRX14411251-SRX14411274).

Les lectures obtenues à partir de cette étude ainsi que toutes les lectures de notre expérience précédente avec MIT9312 et EZ55 [7] ont été analysées ensemble ici. Les lectures de séquence (c'est-à-dire les fichiers d'appel de base BCL par cycle) ont été traduites en fichiers FASTQ par lecture pour une analyse en aval à l'installation de séquençage avec le logiciel bl2fastq en utilisant les paramètres par défaut ainsi que le découpage de l'adaptateur pour supprimer les codes à barres. Nous avons suivi une version légèrement modifiée du flux de travail décrit dans [23] pour le comptage d'alignement et la transcription différentielle des gènes en utilisant les packages Rsubread et edgeR dans R v4.02 [24]. La distribution des scores de qualité FASTQ a été évaluée avec la fonction qualityScores. Les génomes de référence des cyanobactéries ont été obtenus auprès d'Ensemble Bacteria (ASM1264v1, ASM1458v1, ASM19597v1, respectivement pour MIT9312, CC9311 et WH8102). Les données EZ55 ont été obtenues auprès d'IMG/M (taxon ID 2785510739) ; cet assemblage complet du génome [25] était une version supérieure à celle utilisée dans notre précédente analyse de MIT9312 [7]. Les indices génomiques ont été construits avant l'alignement à l'aide de la fonction buildindex. Par la suite, les lectures ont été alignées sur les indices à l'aide des paramètres par défaut de la fonction d'alignement. Les fichiers BAM résultants ont été comptés par rapport aux génomes annotés cyanobactériens et EZ55 à l'aide de la fonction featurecounts.

Nous avons estimé les probabilités de transcription différentielle des gènes (DGE) et le nombre de fois où les transcrits ont été modifiés à l'aide de edgeR. Avant l'analyse DGE, les comptes de gènes avec de faibles niveaux de transcription ont été filtrés à l'aide de la fonction filterByExpr, et les comptes restants ont été normalisés à l'aide de la fonction calcNormFactors pour éliminer les biais de composition entre les bibliothèques. Les modèles linéaires généraux ont estimé les dispersions communes, de tendance et par étiquette et les impacts de différents paramètres de conception expérimentale sur les décomptes normalisés (fonction glmFIT). Pour les cyanobactéries, une matrice de conception a été préparée pour tester le DGE entre les deux conditions expérimentales de pCO2. Pour Alteromonas EZ55, notre matrice de conception a testé les effets de la coculture et du pCO2, ainsi que l'interaction entre ces deux facteurs. L'analyse statistique a été effectuée sur la base de notre modèle ajusté et les contrastes personnalisés suivants ont été appliqués à l'aide de la fonction makeContrasts : (i) l'effet du traitement (c'est-à-dire 800 ppm contre 400 pCO2) ; (ii) l'effet général de la coculture moyenné sur tous les partenaires ; (iii) l'effet de cyanobactéries spécifiques en plus de la réponse générale de co-culture ; (iv) l'interaction générale entre co-culture et pCO2 ; et (v) l'interaction entre des cyanobactéries spécifiques et pCO2 en plus du terme d'interaction général. Un DGE significatif a été défini comme des gènes ayant des valeurs p non ajustées < 0, 05 et un changement de facteur logarithmique (logFC)> 1 dans des comparaisons par paires au sein de notre modèle. Les gènes DGE pour les cyanobactéries ont été testés pour l'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) à l'aide de la fonction gseKEGG dans le package clusterProfiler. Les niveaux de transcription pour EZ55 ont été analysés à l'aide de l'analyse de surreprésentation (ORA) avec la fonction enrichKEGG dans clusterProfiler [26].

Nous avons étudié la capacité d'EZ55 à se développer sur des intermédiaires métaboliques dans la voie de la photorespiration en tant que seule source de carbone. Les solutions mères de glycine, de glycolate, de glucose et de glyoxylate (concentrations de 20 %, 4 %, 4 % et 10 % P/V, respectivement) ont été stérilisées par filtration à l'aide d'un filtre de 0,2 μM. Le pH des stocks de glycolate et de glyoxylate a été ajusté à environ 7 en utilisant du NaOH 10 M. Les clones EZ55 ont été inoculés dans de l'ASW additionné de nutriments Pro99 [21] et de glucose à 0,1 % (P/V) [25] et acclimatés pendant 24 heures à 28 °C avec agitation orbitale à 120 tr/min. Après acclimatation, les cultures ont été diluées 1000 fois dans 10 ml de Pro99 (sans glucose) pour une culture supplémentaire de 24 h dans les mêmes conditions de culture, puis 5 μl de chaque culture ont été ajoutés dans des puits en double d'une plaque transparente à 96 puits stérilisée aux UV. contenant 215 μL de milieu Pro99 avec soit de la glycine, du glycolate, du glyoxylate ou du glucose à une concentration de 0,1 % comme sources de carbone, soit sans carbone ajouté (comme témoin négatif). La plaque a été scellée avec un film de scellement transparent stérilisé aux UV et cultivée dans un lecteur de plaque Synergy H1 (Biotek, Vermont, États-Unis) à 28 ° C pendant 48 h en mode de lecture continue, en collectant une densité optique de longueur d'onde de 600 nm à des intervalles de 5 min. Le taux de croissance exponentiel d'une culture a été déterminé comme la pente maximale de sa courbe de croissance, déterminée par des régressions linéaires de la DO en fonction du temps dans une fenêtre temporelle glissante [27].

La détection de H2O2 intracellulaire a été réalisée selon Lu et al. [28], avec une légère modification. En bref, 1,5 ml de culture a été centrifugé à 8 000 tr/min pendant 5 min, le surnageant a été éliminé et le culot a été remis en suspension dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (pH = 7,4, Fisher). 5 µl de diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine 1 mM ont été ajoutés à la remise en suspension et vortexés pendant 5 secondes puis incubés pendant 1 h sur un agitateur (120 tr/min) dans l'obscurité. La suspension a été centrifugée à 8000 rpm pendant 5 min, le culot a été lavé deux fois avec du PBS, et enfin remis en suspension dans 200 μl de PBS. La fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux à des longueurs d'onde d'excitation/émission de 485/535 nm. Le niveau de H2O2 pour un échantillon a été estimé comme la moyenne du log de fluorescence à 535 nm pour 10 000 événements.

Plusieurs gènes impliqués dans la voie bactérienne d'utilisation du glycolate (glycolate/lactate oxydase, les 3 sous-unités de la glycolate déshydrogénase et la tartronate semialdéhyde réductase) n'étaient pas annotés dans les génomes de référence de nos organismes, nous avons donc spécifiquement cherché à les détecter à l'aide d'une analyse BLAST réciproque. Nous avons récupéré toutes les séquences de chacun des quatre génomes de référence avec une forte similarité (valeur E < 0,001) avec les gènes pertinents d'Escherichia coli et/ou de Synechococcus elongatus en utilisant blastp [29], puis avons rétro-apparié chaque séquence récupérée à E. coli ou le génome de référence de S. elongatus. Si la correspondance réciproque était le même gène utilisé dans la recherche BLAST originale, nous avons considéré la correspondance comme significative. Les séquences récupérées ont été alignées à l'aide de MUSCLE 3.8.425 [30] et visualisées dans MVIEW via l'interface Web EMBL-EBI [31]. Des arbres de maximum de vraisemblance bootstrapés des séquences GlcDF et GOX/LOX ont été créés dans la version 11 de MEGA ; les paramètres du modèle pour la construction de l'arbre ont été choisis en fonction de la combinaison qui a minimisé le critère d'information bayésien pour l'ajustement du modèle pour chaque ensemble de données à l'aide de l'outil de sélection de modèle de MEGA [32].

La croissance de Synechococcus CC9311 n'a pas été significativement affectée par les conditions de pCO2 en co-culture avec Alteromonas EZ55, tandis que Synechococcus WH8102 a connu des réductions de croissance similaires, bien que moins sévères, à celles que nous avons observées précédemment chez Prochlorococcus MIT9312 [7] (Fig. S1). WH8102 avait en fait un taux de croissance exponentiel significativement élevé sous 800 ppm de pCO2 (augmentation d'environ 11% basée sur un modèle linéaire à effets mixtes, p = 0,009), mais une durée de phase de latence significativement accrue (2,1 ± 0,5 d, modèle linéaire à effets mixtes, p < 0,001) et la mort cellulaire post-transfert (perte de 7,8 ± 6,5 %, modèle linéaire à effets mixtes, p = 0,001) ont inversé cette augmentation du taux de croissance et ont conduit à un taux de croissance réalisé ou malthusien significativement réduit (réduction d'environ 17 % , modèle linéaire à effets mixtes, p = 0,006). Nous n'avons pas observé la croissance des souches de Synechococcus axéniques pour cette étude, nous ne pouvons donc pas déterminer si ces différences reflètent ou non un changement dans le comportement "d'aide" d'EZ55, comme cela a été observé pour MIT9312 [7].

MIT9312, CC9311 et WH8102 avaient 37, 30 et 13 gènes significativement (logFC> 1, p <0, 05) transcrits de manière différentielle entre les traitements pCO2 (Fig. S2, Tableau S1). Conformément à notre rapport précédent utilisant un pipeline différent sur les mêmes séquences [7], MIT9312 a diminué la transcription des gènes de la coquille du carboxysome, des gènes RUBISCO et de plusieurs gènes inductibles par la lumière élevée (HLI), et a augmenté la transcription de la répétition de la spectrine "co-culture". gène de réponse" [33] (Fig. S3A). En revanche, WH8102 a augmenté la transcription des gènes RUBISCO et carboxysome (Fig. S3B) ainsi que de plusieurs gènes d'acquisition N. Comme MIT9312, CC9311 a régulé négativement les gènes HLI ainsi que d'autres gènes liés au stress (Fig. S3C). GSEA a confirmé la régulation à la baisse des voies de fixation du carbone dans MIT9312 (Fig. 1A) et la régulation à la hausse de la fixation du carbone, de l'acquisition de nutriments et d'autres voies cataboliques et anaboliques dans WH8102 (Fig. 1B). MIT9312 a également augmenté la transcription de son système de réparation des mésappariements d'ADN sous pCO2 élevé. CC9311 a régulé à la hausse la synthèse de protéines d'antenne de photosynthèse et la biosynthèse d'aminoacyl-ARNt sous pCO2 élevé (Fig. 1C).

Les gènes ont été regroupés en ensembles à l'aide des annotations KEGG pour Prochlorococcus MIT9312 (A), Synechococcus WH8102 (B) et Synechococcus CC9311 (C) représentant des catégories régulées de manière différentielle entre 400 et 800 ppm de pCO2. Les scores d'enrichissement normalisés (NES) indiquent la distribution des catégories KEGG sur une liste de gènes classés par score hypergéométrique (HGS). Des scores d'enrichissement plus élevés indiquent un déplacement des gènes appartenant à la catégorie KEGG indiquée vers l'une ou l'autre extrémité de la liste classée représentant une régulation vers le haut ou vers le bas (valeurs positives ou négatives, respectivement).

De nombreux autres gènes étaient significativement régulés de manière différentielle sous 800 ppm de pCO2 dans EZ55 par rapport à l'une des cyanobactéries testées (tableau S2, figure S4A). Les gènes pour la biosynthèse des acides aminés et des peptidoglycanes ainsi que le catabolisme de divers sucres étaient surreprésentés (Fig. S5A). Tous les gènes statistiquement différentiellement transcrits dans les trois catégories KEGG les plus surreprésentées ont été régulés à la baisse. En revanche, la catégorie catabolisme de l'amidon et du saccharose a révélé que deux enzymes α-amylase glycoside hydrolase, la saccharose phosphorylase et l'amylosaccharase, étaient davantage transcrites à 800 ppm.

Nous avons également pu comparer les transcriptomes axéniques EZ55 à ceux en co-culture avec des cyanobactéries. L'impact de la co-culture sur EZ55 était beaucoup plus prononcé que celui de pCO2. Remarquablement, 1144 gènes ont été significativement transcrits de manière différentielle en co-culture avec des cyanobactéries par rapport à EZ55 axénique (Fig. S4B, Tableau S3). De plus, la réponse pCO2 a été modulée de manière significative par co-culture pour 457 gènes (Fig. S4C, Tableau S4). Des voies KEGG plus surreprésentées ont été identifiées pour la réponse de co-culture (Fig. S5B) et l'interaction de la co-culture avec pCO2 (Fig. S5C) que pour pCO2 seul (Fig. S5A).

Dans l'ensemble, les transcrits des gènes liés au stress à régulation différentielle étaient épuisés par rapport à l'EZ55 axénique à 400 ppm de pCO2, à la seule exception du facteur sigma en phase stationnaire (rpoS) de l'ARN polymérase (Fig. 2; Tableau S5). Ces gènes comprenaient les enzymes antioxydantes catalase, catalase-peroxydase et alkyl hydroperoxyde réductase. Co-cultures à 400 ppm de transcriptions régulées à la hausse pour les transporteurs de N, P, Fe, acides organiques (par exemple, glycolate, acétate, lactate) et une grande variété de substrats carbonés (Fig. S6; Tableau S6). D'autre part, à 800 ppm de pCO2, la plupart des gènes de stress étaient régulés positivement en co-culture, et la plupart des transporteurs avaient une transcription inchangée par rapport à EZ55 axénique.

Les parcelles représentent la réponse générale à la co-culture (colonne 1) et à la co-culture avec des cyanobactéries spécifiques (colonnes 2-4) à 400 ou 800 ppm de pCO2, par rapport à la transcription dans des conditions axéniques au même pCO2. Le changement de pli log2 (logFC) est tracé sur l'axe des abscisses par rapport à Alteromonas axénique dans les mêmes conditions de pCO2. Les gènes différentiellement transcrits (p < 0,05 et logFC > 1) sont surlignés en noir. Les barres noires dans la colonne 1 indiquent que la réponse moyenne de la co-culture est significativement différente de la réponse axénique au même pCO2 ; les barres noires dans les colonnes 2 à 4 indiquent une différence significative entre la réponse cyanobactérienne spécifique et la réponse générale de coculture indiquée dans la colonne 1.

Les transcriptions de la plupart des gènes de chimiotaxie étaient plus abondantes en co-culture par rapport à l'axenique à 400 ppm, mais généralement non affectées ou régulées négativement en co-culture à 800 ppm (Fig. S7; Tableau S7). D'autre part, les gènes liés aux flagelles étaient pour la plupart régulés négativement dans les co-cultures à 400 ppm mais régulés positivement à 800 ppm. De nombreux gènes du métabolisme central du carbone étaient également régulés de manière différentielle, les enzymes impliquées dans le catabolisme du glyoxylate / dicarboxylate, du propanoate, du pyruvate et des acides aminés étant fortement surreprésentées (Fig. S8; Tableau S8). La plupart des transcrits du métabolisme central transcrits de manière différentielle ont été enrichis en co-culture à 400 ppm, à l'exception des gènes codant pour les enzymes du cycle du méthylcitrate et de la synthèse de la glycine bétaïne à partir de la choline, qui ont été régulés à la baisse. À 800 ppm, cependant, seules deux enzymes du métabolisme central ont été transcrites de manière différentielle dans la co-culture, et les deux ont été appauvries par rapport à la croissance axénique.

La section précédente a analysé la réponse générale de co-culture d'EZ55, mais notre analyse a également révélé de nombreux gènes qui ont été transcrits de manière différentielle en fonction du partenaire cyanobactérien avec lequel EZ55 a été cultivé (Fig. S4, panneaux DF ; Tableaux S9, S10, S11). Pour beaucoup d'entre eux, la réponse de co-culture spécifique à la souche était également différente entre les traitements au pCO2 (Fig. S4, panneaux GI, Tableaux S12, S13, S14). Des catégories KEGG similaires étaient surreprésentées dans la réponse d'EZ55 à la co-culture avec des cyanobactéries spécifiques par rapport à la co-culture en général (Fig. S5, panneaux DI), ce qui suggère que ces différences spécifiques à l'espèce reflétaient l'adaptation des mêmes voies générales plutôt que des différences fondamentales dans réponse métabolique. En revanche, il y avait moins de différences significatives spécifiques à l'espèce dans la transcription des gènes par rapport à la réponse générale de co-culture à 800 ppm. Une différence notable était qu'à 400 ppm, la plupart des gènes liés au stress EZ55 étaient plus fortement transcrits avec MIT9312 qu'avec l'une ou l'autre des souches de Synechococcus (Fig. 2). De plus, les gènes codant pour deux catalases EZ55 ainsi que l'alkyl hydroperoxyde réductase ont été diminués à 800 ppm en co-culture avec MIT9312 mais augmentés avec WH8102, et inchangés par rapport à la réponse générale de co-culture pour CC9311.

La transcription de certains gènes d'acquisition de nutriments était également spécifique à la souche (Fig. S6) et, comme pour les gènes de stress, présentait des schémas nettement différents pour les co-cultures avec MIT9312 par rapport aux souches de Synechococcus. Par exemple, à 400 ppm, le transporteur EZ55 NH4 + a été régulé positivement en co-culture avec MIT9312 et WH8102, mais à 800 ppm, les transcrits du transporteur NH4 + ont considérablement diminué en co-culture avec MIT9312 mais pas avec l'une ou l'autre des souches de Synechococcus. Quelques transporteurs de carbone organique EZ55 ont également modifié la transcription en réponse au pCO2 d'une manière spécifique à l'espèce. Par exemple, à 400 ppm, les transcrits codant pour deux perméases de fucose ont été régulés positivement en co-culture avec MIT9312 (bien qu'un troisième ait été régulé négativement), et un transporteur d'acétate a été plus fortement transcrit avec WH8102. Les gènes de transport de la vitamine B ont été régulés positivement en co-culture avec MIT9312 sous 400 ppm et avec WH8102 sous 800 ppm. Les schémas de transcription spécifiques à l'espèce de la chimiotaxie et des gènes flagellaires étaient similaires aux tendances observées pour la réponse générale de co-culture, bien que l'ampleur des changements variait considérablement entre les souches dans de nombreux cas (Fig. S7).

À 400 ppm de pCO2, de nombreux gènes du métabolisme central étaient transcrits différemment dans EZ55 par rapport à la culture axénique en fonction du partenaire cyanobactérien spécifique (Figs. S8, 3, S9). Par exemple, EZ55 co-cultivé avec les deux souches de Synechococcus a augmenté la transcription des gènes impliqués dans le système de clivage de la glycine (GCS), bien que l'ampleur du changement n'ait été significative que lorsqu'il était associé à CC9311 ; en revanche, ces gènes ont été régulés négativement en co-culture avec MIT9312. Les enzymes glyoxylates shunt bactériennes, la malate synthase et l'isocitrate lyase, dont les métabolites chevauchent GCS, ont été régulées positivement en co-culture avec WH8102. EZ55 co-cultivé avec des souches de Synechococcus mais pas avec MIT9312 a augmenté la transcription des gènes de catabolisme de la valine et de l'acétate et a diminué la transcription des gènes de synthèse de la glycine bétaïne. EZ55 associé à MIT9312 a augmenté la transcription des gènes codant pour la pyruvate déshydrogénase. La bêta-oxydation des acides gras était généralement régulée positivement à 400 ppm mais régulée négativement à 800 ppm. Le métabolisme de la glycine bétaïne était régulé négativement pour les co-cultures EZ55 avec CC9311 à 400 ppm mais régulé positivement à 800 ppm. Dans l'ensemble, il y avait moins de changements réglementaires spécifiques à l'espèce par rapport à la croissance axénique à 800 ppm de pCO2 qu'à 400 ppm.

Panneau A, 400 ppm pCO2 ; Panneau B, 800 ppm pCO2. Les petits graphiques en médaillon indiquent le changement de pli logarithmique de la transcription, par rapport à la culture axénique dans les mêmes conditions de pCO2, en co-culture avec MIT9312 (barres vertes), CC9311 (barres roses) ou WH8102 (barres orange). Les noms de gènes correspondent aux gènes apparentés dans E. coli. Seuls les gènes qui ont été transcrits différemment entre axénique et co-culture dans au moins une condition sont présentés ; toutes les barres ne représentent pas des différences significatives, et des tests statistiques spécifiques pour tous les produits géniques sont présentés à la Fig. S8. Les métabolites en caractères gras sont supposés être des exsudats échangés entre les constituants de la co-culture dans certaines conditions. Les couleurs des flèches indiquent lequel des quatre génomes est capable d'effectuer la réaction indiquée sur la base des fonctions géniques annotées et de nos propres analyses phylogénétiques (Figs. S10–S13) ; voir la légende en médaillon pour l'explication.

Nous avons étudié la possibilité que EZ55 puisse être capable de métaboliser les sous-produits de la photorespiration, qui peuvent être moins abondants à 800 ppm de pCO2 et peuvent être obligatoirement sécrétés par les cyanobactéries. Tout d'abord, nous avons reconstruit les voies de catabolisme du glycolate dans les quatre organismes à partir d'informations génomiques (Fig. 3). Pour détecter les gènes éventuellement mal annotés pour les lacunes dans les voies, nous avons effectué des requêtes BLAST réciproques en utilisant des séquences d'acides aminés pour les gènes manquants d'Escherichia coli et/ou de Synechococcus elongatus (Fig. S10). Tout d'abord, nous avons confirmé qu'il n'y avait pas d'analogue de la 2PG phosphatase dans le génome MIT9312. Nous avons découvert des candidats pour la tartronate semialdéhyde réductase dans EZ55 et les deux souches de Synechococcus, mais aucun candidat hydroxypyruvate isomérase pour Synechococcus ou glyoxylate carboligase pour aucun organisme. Nous avons découvert des candidats pour glcD, l'une des sous-unités de la glycolate déshydrogénase, dans les quatre génomes, mais seules les deux souches de Synechococcus avaient des correspondances pour les deux autres sous-unités glcE et glcF. Parce que les trois gènes sont nécessaires pour fonctionner dans E. coli [34], nous avons étudié de plus près les phylogénies des candidats glcD dans EZ55 et MIT9312. Le glcD MIT9312 est tombé dans un clade contenant le glcD alternatif découvert dans Synechocystis PCC6803 [35], et des versions de ce glcD2 ont également été trouvées dans les deux génomes de Synechococcus étudiés ici (Fig. S11). Cependant, il n'est pas clair si cette enzyme peut catalyser la conversion du glycolate en glyoxylate sans l'aide des sous-unités glcEF [35]. La protéine EZ55, d'autre part, était presque deux fois plus longue que la GlcD d'E. coli, et nous avons découvert que la longue extension C-terminale était assez similaire à la protéine GlcF Fe-S d'E. coli, suggérant que cette nouvelle grande la protéine peut être capable de catalyser la réaction effectuée par les trois sous-unités glc par elle-même. Nous avons également découvert que cette grande protéine de fusion GlcDF était conservée dans toutes les gammaprotéobactéries marines, mais pas dans E. coli ou Pseudomonas aeruginosa (Fig. S11). Les gènes glcDF que nous avons découverts appartenaient à deux clades, l'un regroupé avec les gènes glcD et glcF précédemment caractérisés avec un support d'amorçage élevé, et un autre (qui comprenait le gène EZ55) qui représentait une lignée évolutive distincte intermédiaire entre glcD2 et le canonique E. Coli enzyme à trois protéines.

Le génome EZ55 contenait également deux gènes similaires à la lactate oxydase lctD d'E. coli. Il a été démontré que les lactate oxydases bactériennes (LOX) agissent également sur le glycolate et on pense qu'elles sont les ancêtres de l'enzyme glycolate oxydase productrice de H2O2 (GOX) trouvée dans les plantes [36]. Une analyse plus approfondie a révélé que les protéines EZ55 et E. coli s'alignaient bien avec la GOX eucaryote ainsi qu'avec une LOX productrice de H2O2 de Streptococcus pyogenes [37] (Fig. S12). Les candidats GOX/LOX n'ont pu être trouvés dans aucun génome de Synechococcus examiné (y compris les deux étudiés ici), ni dans aucun génome de Prochlorococcus de clade à haute luminosité (bien que deux souches à faible luminosité, MIT9211 et NATL2A, aient eu des gènes candidats). Il est donc possible qu'EZ55 puisse utiliser la voie GOX végétale plus efficace pour le catabolisme du glycolate, produisant du H2O2 comme sous-produit. Nous n'avons trouvé aucune preuve de la voie du cycle bêta-hydroxyaspartate pour l'utilisation du glycolate [38] dans aucun des quatre génomes.

Sur la base de ces preuves génomiques, nous avons conclu que les souches Synechococcus et EZ55 étaient capables de récupérer complètement le 2-phosphoglycolate (2PG), le produit proximal de la photorespiration, en utilisant soit le GCS, le shunt TCA glyoxylate ou le glycérate (Fig. 3) [ 35]. Au moins une de ces voies a été régulée positivement pour EZ55 en co-culture avec chaque partenaire cyanobactérien à 400 ppm de pCO2 (Fig. 3). Le MIT9312, en revanche, ne disposait pas d'un ensemble complet d'enzymes pour convertir le 2PG en glyoxylate, et nous avons donc prédit que le MIT9312 doit excréter le 2PG dans le milieu à une vitesse relativement constante pendant la fixation du carbone. Nous avons donc étudié la capacité d'EZ55 à se développer sur divers métabolites liés au 2PG. Les cultures axéniques EZ55 se sont développées sur du glycolate, du glyoxylate et de la glycine comme seules sources de carbone (Fig. 4A), mais avec des taux de croissance significativement plus faibles que sur du glucose (ANOVA suivie d'un test post-hoc de Tukey, p <0, 05). Nous avons également mesuré H2O2 intracellulaire dans des cultures EZ55 poussant sur du glucose ou du glycolate (Fig. 4B). Les cultures cultivées au glycolate avaient une fluorescence induite par H2O2 significativement plus élevée que les cultures de glucose (ANOVA, p < 0,05), ce qui correspond à l'activité GOX dans EZ55.

Un taux de croissance exponentiel de EZ55 sur trois composés liés à la photorespiration, par rapport à un milieu positif (glucose) et négatif (milieu Pro99 sans C non amendé). B Teneur en H2O2 intracellulaire dans les cellules EZ55 se développant sur du glucose ou du glycolate, représentée par le log de fluorescence (FL) moyen des cellules colorées au DCFH-DA analysées par cytométrie en flux.

Nous avons cherché à comprendre l'impact du changement de pCO2 (400 contre 800 ppm, représentant les concentrations actuelles et projetées de l'année 2100) sur Prochlorococcus et Synechococcus et ses effets sur leurs interactions avec la bactérie hétérotrophe "helper" co-cultivée Alteromonas sp. EZ55. Conformément à nos recherches précédentes [7], EZ55 était plus fortement affecté par le pCO2 de l'année 2100 que n'importe lequel des photoautotrophes de notre étude malgré la dépendance primaire du métabolisme de ces derniers organismes vis-à-vis du CO2. De manière frappante, une pCO2 élevée avait tendance à réduire ou à éliminer l'effet de la co-culture sur EZ55, beaucoup moins de gènes étant significativement transcrits de manière différentielle par rapport à EZ55 axénique au même pCO2. Ainsi, pCO2 a fortement impacté la conversation métabolique entre les cyanobactéries et EZ55. Notre analyse détaillée des voies métaboliques régulées de manière différentielle a suggéré trois mécanismes qui se renforcent mutuellement sous-jacents à cette interaction dynamique : (i) les impacts de la pCO2 sur la libération de métabolites dérivés de cyanobactéries "fuyants", (ii) l'altération de la dynamique de la compétition sur les nutriments inorganiques entre le co -organismes cultivés, et (iii) modulation des états de stress bactériens et phytoplanctoniques. Nous explorons chacun de ces mécanismes plus en détail ci-dessous.

Les milieux que nous avons utilisés pour la coculture du phytoplancton et des bactéries ne contenaient aucune source de carbone exogène ; par conséquent, EZ55 dépendait des exsudats cyanobactériens pour se développer, et il est probable qu'une grande partie de sa transcription modifiée reflétait la disponibilité changeante des métabolites extracellulaires dans le milieu. La régulation à la hausse significative du catabolisme du carbone et des gènes de transport ainsi que des gènes de chimiotaxie dans les co-cultures par rapport à EZ55 axénique soutient l'idée que la reminéralisation bactérienne des composés organiques sécrétés par les cyanobactéries est une force motrice dans ces écosystèmes simples. De plus, les modifications de la transcription des gènes de catabolisme et de transport des glucides fournissent des indices sur les métabolites sécrétés dans différentes conditions expérimentales (Fig. 5).

Les reconstructions sont présentées pour quatre contextes communautaires différents (culture axénique ou co-culture avec Prochlorococcus MIT9312, Synechococcus WH8102 ou Synechococcus CC9311) à 400 ou 800 ppm de pCO2, reflétant les changements possibles dans la disponibilité des composés C, les facteurs limitant la croissance et le stress. conditions compatibles avec les observations différentielles de transcription génique. L'image EZ55 a été obtenue par microscopie cryoélectronique à partir des sessions rapportées dans Hennon et al. [7]. Les couleurs de fond de chaque partenaire correspondent aux couleurs des barres de la Fig. 3.

Comme tous les phototrophes oxygéniques, les cyanobactéries étudiées ici fixent le carbone grâce à l'enzyme rubisco, qui catalyse également la réaction indésirable de photorespiration conduisant à la production de 2PG au lieu de photosynthate. Il a été observé que le phytoplancton au champ et en culture excrète des acides carboxyliques de faible poids moléculaire, y compris le glycolate [39,40,41]. Le glycolate photorespiratoire est l'une des sources de carbone les plus abondantes dans les océans [38] et un substrat de croissance préféré pour certaines bactéries marines hétérotrophes [42]. De plus, le gène bactérien glcD pour la conversion du glycolate en glyoxylate est transcrit de manière ubiquitaire dans l'océan [41, 43]. Bien que EZ55 n'ait pas de transporteur spécifique pour le glycolate, il peut être absorbé par la cellule en utilisant les mêmes transporteurs que ceux utilisés pour l'absorption d'acétate et de lactate [44, 45], tous deux régulés positivement dans des conditions de co-culture à 400 ppm (Fig. 3 ). Nos données ont également montré une régulation différentielle des enzymes impliquées dans les voies de catabolisme du glycolate, avec au moins une voie régulée positivement en co-culture avec chaque souche de cyanobactérie (Fig. 3). Nous avons en outre démontré que les cultures EZ55 étaient capables de croître sur du glycolate comme seule source de carbone, en utilisant éventuellement une nouvelle protéine de fusion GlcDF (Fig. S11) et / ou une enzyme LOX / GOX de type végétal (Fig. 4). Ainsi, les sous-produits photorespiratoires sont probablement une source de carbone pour EZ55 dans ces cultures, en particulier en présence de MIT9312, qui n'a pas d'enzymes détectables pour récupérer le 2PG seul.

Il y avait également des preuves que EZ55 utilisait des acides aminés, des acides organiques et des acides gras produits par le phytoplancton dans certaines conditions dans ces cultures (Fig. S9). Les transporteurs de lactate, d'acétate et de propanoate et les voies de catabolisme ont été régulés positivement en co-culture avec toutes les cyanobactéries, tout comme la pyruvate déshydrogénase avec MIT9312, mais seulement à 400 ppm. Le catabolisme de la valine et de la glycine a également été régulé positivement à 400 ppm en co-culture avec les deux souches de Synechococcus, et le catabolisme des acides gras a été régulé positivement en co-culture avec MIT9312 et CC9311 à 400 ppm de pCO2. La plupart de ces substances ont été observées directement ou indirectement dans des cultures de cyanobactéries lors d'études antérieures. Par exemple, le glycolate, le lactate, l'acétate et le pyruvate ont été directement mesurés dans les milieux épuisés de Prochlorococcus [39], et la co-culture avec Prochlorococcus peut répondre aux exigences de croissance SAR11 pour la glycine et le pyruvate [46]. Les gènes du catabolisme des acides gras peuvent avoir ciblé des vésicules membranaires qui sont abondamment libérées par Prochlorococcus et d'autres bactéries marines et peuvent être une source importante de carbone pour les hétérotrophes dans l'océan [47, 48] ; si tel est le cas, les études futures devraient déterminer si WH8102 produit moins de vésicules que les deux autres cyanobactéries, expliquant la transcription différentielle des gènes de bêta-oxydation observée ici.

Les voies cataboliques de la valine, des acides gras et du propanoate se croisent avec la formation de propanoyl-coA qui, chez les bactéries, est généralement introduit dans le cycle du TCA par la voie du méthylcitrate [49], qui a été significativement régulée négativement à 400 ppm en co-culture avec toutes les cyanobactéries même bien que d'autres gènes de ces voies aient été régulés positivement. Par conséquent, on ne sait pas quel est le sort ultime du carbone provenant de ces sources, bien qu'il soit possible que EZ55 soit capable de convertir le propanoyl-coA en un intermédiaire du cycle TCA par une autre voie alternative (par exemple, comme cela a été décrit dans Mycobacterium tuberculosis via la voie méthylmalonyle [50]).

Notamment, la transcription génique liée à l'utilisation de tous ces produits a diminué à 800 ppm de pCO2 (Figs. 3, S8, S9). Cela n'était pas inattendu pour les enzymes dans les voies d'utilisation du glycolate, car l'augmentation du rapport CO2/O2 à 800 ppm devrait diminuer le taux de photorespiration par rapport à la fixation du carbone et donc la disponibilité des métabolites photorespiratoires comme le glycolate [51, 52]. Il n'est cependant pas clair pourquoi les acides organiques et gras seraient moins abondants dans les exsudats de cyanobactéries à 800 ppm. Une possibilité est que les cyanobactéries libèrent moins de ces composés dans le milieu à pCO2 élevé en raison d'un changement de leur état redox interne dans ces conditions favorisant l'oxydation complète du photosynthate. Si les conditions futures de pCO2 modifient fondamentalement le caractère des exsudats de phytoplancton, cela pourrait avoir de profondes implications pour l'évolution et le fonctionnement des écosystèmes dans les futurs océans.

Les cyanobactéries autotrophes et les EZ55 hétérotrophes étaient peu susceptibles de rivaliser avec le carbone dans nos conditions expérimentales, mais nous avons observé des preuves de compétition avec les nutriments inorganiques tels que N, P et Fe. Les transporteurs de phosphate, d'ammonium et de fer EZ55, la protéine régulatrice de l'azote P-II et la glutamine synthétase (la principale porte d'entrée pour l'assimilation de N dans les bactéries) étaient tous plus fortement transcrits pour toutes les co-cultures par rapport aux cultures axéniques à 400 ppm de pCO2 (Fig. S6), suggérant un passage de la limitation du carbone axénique à la limitation des nutriments en présence d'un apport continu de carbone dérivé de la photosynthèse (Fig. 5). D'autre part, peu de transporteurs de nutriments ont été régulés positivement par rapport à l'axenique sous 800 ppm de pCO2. Bien que les données de transcription génique seules ne soient pas suffisantes pour conclure si Alteromonas est limité par des nutriments inorganiques ou organiques, l'importance réduite de l'acquisition de nutriments suggère que EZ55 est limité en carbone dans ces conditions, tout comme en l'absence de cyanobactéries.

Il y avait relativement peu de changements spécifiques à l'espèce dans la transcription du gène du transporteur de nutriments EZ55. Un exemple était un transporteur d'ammonium, qui était fortement régulé positivement en co-culture avec les deux cyanobactéries en haute mer (MIT9312 et WH8102) à 400 ppm de pCO2. Cela peut refléter une réponse à une affinité relativement élevée pour le N chez les cyanobactéries adaptées à l'océan ouvert oligotrophe en permanence, ce qui en fait des concurrents beaucoup plus puissants pour limiter le N que le CC9311 côtier. Il a été observé que la compétition de N avec EZ55 augmentait l'aptitude compétitive relative de Prochlorococcus par rapport à Synechococcus (souche côtière WH7803) dans des co-cultures à 3 voies [53]. En revanche, WH8102 semble avoir une demande en N plus élevée sous 800 ppm de pCO2, régulant significativement à la hausse un transporteur de nitrate et plusieurs gènes liés à l'utilisation de l'urée (Fig. S2). Cela peut s'expliquer par la transcription améliorée des gènes de fixation du carbone et des taux de croissance exponentiels plus rapides observés dans WH8102 à pCO2 élevé, augmentant la demande en N, et peut indiquer que WH8102 était limité en C à 400 ppm.

Il est important de noter que différentes sources de N ont été fournies dans le milieu PEv (dans lequel les co-cultures axéniques EZ55 et MIT9312 ont été cultivées) et le milieu SEv (dans lequel les co-cultures CC9311 et WH8102 ont été cultivées), avec NH4+ dans le premier et NO3 - dans ce dernier. Cependant, nous ne pensons pas que cette différence puisse expliquer les changements observés dans la régulation des gènes, car EZ55 est capable de croître en utilisant l'une ou l'autre des sources de N. Il est intéressant de noter, cependant, que le transporteur d'ammonium d'EZ55 était régulé positivement dans les deux types de milieux (Fig. S6), ce qui suggère qu'il pourrait bénéficier de l'ammonium excrété par Synechococcus dans les co-cultures de SEv.

EZ55 a montré moins de transcription de gènes liés au stress à 400 qu'à 800 ppm de pCO2, et également moins de preuves de stress en co-culture avec n'importe quelle cyanobactérie qu'en culture axénique seule. Presque tous les gènes du génome EZ55 liés à la protection contre H2O2 ont été régulés négativement en co-culture à 400 ppm, tout comme une suite d'autres gènes liés au stress (Fig. 2) ; d'autre part, bon nombre de ces gènes étaient significativement régulés positivement par rapport aux conditions axéniques à 800 ppm. De plus, à 800 ppm, il y avait une différence prononcée dans la transcription du gène de défense EZ55 H2O2 entre les partenaires cyanobactériens. Comme nous l'avons décrit précédemment [7], les deux catalases monofonctionnelles ont été régulées négativement à 800 ppm en co-culture avec MIT9312, tout comme 2 des 3 gènes d'alkylhydroperoxyde réductase (bien que le troisième ait été significativement régulé positivement). En revanche, les gènes de catalase monofonctionnels ont été significativement régulés positivement en co-culture avec WH8102 à 800 ppm. La transcription élevée des gènes impliqués dans la biosynthèse de la glycine bétaïne, un osmoprotecteur qui s'est également avéré fonctionner comme un antioxydant [54, 55], fournit une preuve supplémentaire d'un stress oxydatif accru en co-culture avec Synechococcus à 800 ppm dans EZ55.

Certaines indications du mécanisme derrière le niveau de stress changeant d'EZ55 sous co-culture et pCO2 élevé peuvent être vues dans la dynamique de trois facteurs sigma d'ARN polymérase liés au stress. La rpoE et la rpoH, responsables du contrôle de l'enveloppe et des régulons de stress thermique, respectivement, ont été régulées négativement à 400 ppm en co-culture par rapport aux conditions axéniques et à 800 ppm ; rpoE était significativement régulé positivement à 800 ppm de pCO2. Ces tendances sont cohérentes avec le stress oxydatif induit par la famine dans des conditions à la fois axéniques et à 800 ppm, comme discuté ci-dessus. En revanche, rpoS était régulé positivement à 400 ppm de pCO2, fortement en co-culture avec MIT9312. RpoS est un facteur sigma spécialisé qui s'accumule dans des conditions de privation de nutriments ou lorsque les cellules entrent dans la phase stationnaire et sert à augmenter la résistance générale au stress [56, 57]. Par exemple, chez Escherichia coli, il a été démontré que la RpoS joue un rôle crucial pour la survie pendant la privation d'azote [58]. Alors que le découplage de la transcription des gènes de stress oxydatif comme la catalase de la transcription rpoS était inattendu, les tendances rpoS sont cohérentes avec le fait que EZ55 est limité en nutriments à 400 ppm de pCO2 (Fig. S6) et avec la régulation à la hausse de la catalase en co-culture avec MIT9312, mais pas WH8102 ou CC9311, à 400 ppm (Fig. 2).

Contrairement à EZ55, les gènes différentiellement transcrits liés aux réponses au stress étaient rares chez les cyanobactéries à 800 ppm. Alors que MIT9312 et WH8102 présentaient des troubles de croissance significatifs à 800 ppm (Fig. S1), il y avait peu de preuves d'une réponse de transcription génique spécifique au stress dans l'une ou l'autre des souches. Les gènes de réparation des mésappariements d'ADN ont été enrichis en groupe à 800 ppm dans Prochlorococcus, bien que la seule protéine individuelle liée au stress qui ait été transcrite de manière différentielle était une protéine HLI fortement régulée négativement à 800 ppm. Aucun gène ou ensemble de gènes liés au stress n'a été enrichi dans WH8102, et le petit nombre de gènes de stress transcrits de manière différentielle dans CC9311 (par exemple, les protéines de choc thermique et HLI) ​​ont tous été régulés négativement à 800 ppm. Cela pourrait indiquer une dépendance de MIT9312 et de WH8102 vis-à-vis de leur partenaire EZ55 co-cultivé pour la protection, car aucun de ces génomes cyanobactériens ne contient de catalase ou plusieurs autres gènes de réponse au stress courants chez les bactéries hétérotrophes. Cela pourrait également indiquer qu'ils ont des mécanismes de réponse au stress différents de ceux qui ont été caractérisés chez les bactéries hétérotrophes ; par exemple, plusieurs protéines hypothétiques de fonction inconnue étaient régulées de manière différentielle dans chaque cyanobactérie entre les conditions de pCO2. Enfin, il est possible que les contraintes subies par MIT9312 et WH8102 se soient produites dans les premiers jours après le transfert dans un milieu frais (c'est-à-dire la période de latence significativement prolongée observée pour les deux) et aient été atténuées par la phase logarithmique tardive lorsque les cultures ont été échantillonnées pour Séquençage de l'ARN.

Nous avons montré que la réponse à une pCO2 élevée dans nos co-cultures algues:bactériennes était davantage motivée par les interactions interspécifiques que par les réponses spécifiques au CO2 elles-mêmes. Bien qu'il soit important de noter que nous ne disposons pas de preuves directes basées sur la culture pour certaines de ces affirmations, nous pensons que les preuves de la transcription génique sont solides pour plusieurs conclusions concernant les interactions dans nos cultures (Fig. 5).

Premièrement, l'augmentation de la pCO2 semble avoir fondamentalement modifié la quantité et/ou les types de composés carbonés sécrétés par les trois souches de cyanobactéries examinées, plaçant EZ55 dans un état métabolique en phase stationnaire presque indiscernable d'être dans un milieu de culture sans aucune source de carbone ajoutée. Nous suggérons que cela est directement dû au rapport CO2:O2 plus élevé, qui a réduit le taux de photorespiration et la libération ultérieure de 2PG et / ou de glycolate et indirectement peut avoir réduit la quantité de carbone incomplètement oxydé libéré par les cyanobactéries en modifiant l'état redox intracellulaire. [59]. Peut-être en raison de l'évolution de l'apport de carbone, EZ55 a également semblé s'éloigner d'un état de compétition des nutriments avec ses partenaires cyanobactériens, illustré par une diminution de la transcription des transporteurs de nutriments à pCO2 élevé (Fig. S6).

Deuxièmement, la co-culture à 400 ppm a clairement réduit le stress sur EZ55 par rapport à la croissance axénique ou à la croissance de la co-culture à 800 ppm, probablement en raison de la fourniture d'une source plus fiable de C comme décrit ci-dessus par le partenaire cyanobactérien dans ces conditions. En revanche, MIT9312 et WH8102 ont clairement subi un stress élevé, potentiellement lié aux changements du métabolisme d'EZ55 dans ces conditions. L'une des principales conclusions de nos travaux précédents [7] était la découverte que EZ55 réduisait la transcription de la catalase à 800 ppm de pCO2, éliminant ainsi l'effet "assistant" dont dépend Prochlorococcus pour se développer en culture [13, 14]. Dans ce travail, nous voyons que la réponse de la catalase en co-culture avec MIT9312 était opposée à celle en co-culture avec les deux souches de Synechococcus. Une explication possible à cela réside dans le fait que MIT9312, contrairement aux trois autres souches de cette étude, ne possédait pas une voie de catabolisme 2PG complète et a donc probablement excrété ce produit où il a ensuite été catabolisé par EZ55. Nous avons confirmé par analyse génomique (Fig. S10-S13) et par des expériences de culture (Fig. 4) qu'EZ55 était capable de se développer sur du glycolate comme seule source de carbone et que sa concentration intracellulaire en H2O2 était élevée par rapport à la croissance sur glucose. Nous suggérons que plus de 2PG a été sécrété par MIT9312 à 400 ppm de pCO2 en raison du rapport CO2: O2 inférieur, et que la croissance sur cette source de carbone a augmenté la charge de stress oxydatif interne d'EZ55, entraînant une transcription plus élevée des défenses H2O2 telles que la catalase (Fig. 2 ). Si cela est vrai, cela fournit une explication possible de la raison pour laquelle la relation "assistante" s'est rompue à un pCO2 élevé - en laissant échapper du 2PG comme substrat de croissance facilement disponible pour EZ55 à 400 ppm, MIT9312 a forcé EZ55 à maintenir un degré élevé de défense ROS intracellulaire, conduisant à la capacité bien caractérisée d'EZ55 à protéger de manière croisée les souches de Prochlorococcus contre les concentrations relativement plus faibles de H2O2 dans l'environnement en vrac, et permettant au MIT9312 d'éliminer deux voies enzymatiques énergétiquement coûteuses. Lorsqu'un pCO2 plus élevé réduisait le taux de photorespiration, le besoin d'EZ55 de produire un excès de catalase diminuait, entraînant des niveaux de protection inférieurs et des troubles de croissance concomitants pour MIT9312.

Ceci est un exemple de la façon dont les fonctions qui fuient de la reine noire permettent à des organismes comme Prochlorococcus de rationaliser leur métabolisme tout en créant simultanément des interdépendances stables au sein de leurs communautés. Cependant, cela montre également comment les échanges stabilisés par Black Queen peuvent s'effondrer. Si notre relation hypothétique entre pCO2 et la production de catalase est correcte, alors ce système dépend de la libération passive d'un sous-produit métabolique qui a évolué dans un ensemble de conditions atmosphériques de pCO2 qui ont été largement stables pendant des milliers d'années - mais cela laisse le système particulièrement vulnérable aux changements rapides de pCO2 en cours et peut laisser Prochlorococcus sans aucune protection dans le futur océan. Si Prochlorococcus est devancé par des concurrents moins rationalisés, cela pourrait réduire l'efficacité globale de la production primaire dans les gyres océaniques ouverts avec d'éventuelles rétroactions positives sur l'accumulation de CO2 dans l'atmosphère. Des expériences ultérieures devraient examiner si Prochlorococcus peut surmonter ce déséquilibre par une évolution adaptative assez rapidement pour éviter de graves perturbations de sa niche actuelle.

En conclusion, ces résultats renforcent l'observation selon laquelle les cultures axéniques n'offrent pas une bonne fenêtre sur le comportement des communautés naturelles. Le métabolisme d'Alteromonas sp. EZ55, un consommateur omniprésent dans l'océan, dépendait fortement de son contexte communautaire, et des changements relativement subtils dans l'environnement chimique induits par une pCO2 élevée étaient suffisants pour remodeler de manière significative sa physiologie. De plus, la réponse transcriptionnelle d'EZ55 au changement de pCO2 était bien supérieure à celle de n'importe lequel des photoautotrophes examinés, ce qui suggère que des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les bactéries hétérotrophes souvent ignorées associées aux producteurs primaires marins et comment elles réagiront au changement global de l'océan. . Ainsi, des recherches supplémentaires sont indiquées sur certaines de nos principales découvertes et hypothèses (par exemple, le rôle du 2PG et la nature du carbone échangé entre les cyanobactéries et Alteromonas) via la métabolomique ou des mesures directes du substrat. Ces résultats soulignent en outre l'importance des expériences de laboratoire utilisant des co-cultures comme intermédiaire expérimental traitable entre des cultures axéniques trop simplifiées et des communautés naturelles trop compliquées. Ils mettent également en évidence le rôle dominant que jouent les producteurs primaires dans la détermination du métabolisme et des interactions des organismes qui dépendent d'eux pour leur subsistance.

Nos fichiers de séquences sont accessibles depuis le National Center for Biotechnology Information (BioProject PRJNA377729, Sequence Read Archive accession numbers SRX2619948-SRX2619957, SRX3033334-SRX3033345 et SRX14411251-SRX14411274). Toutes les données générées ou analysées à partir de nos fichiers de séquence ainsi que les données brutes de nos expériences basées sur la culture et analyses phylogénétiques sont archivées sur bco-dmo.org sous les jeux de données 882409, 882390 et 881942.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NSF OCE-1851085 et OCE-1540158 à JJM, une bourse de début de carrière de la Fondation Simons à JJM et un prix NSF GRFP à MW. Nous sommes reconnaissants à Elizabeth Entwistle, Alexander Durrant et Irene Chiang pour leur aide à l'entretien de la culture, James Kizziah et Terje Dokland pour le travail cryo-EM, et Sheann Haley et Sonya Dyhrman pour la préparation et le séquençage de ces échantillons.

Université de l'Alabama à Birmingham Département de biologie, 1300 University Blvd CH464, Birmingham, AL, 35294, États-Unis

Marcelo Malisano Barreto Filho, Zhiying Lu, Melissa Walker et J. Jeffrey Morris

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Correspondance à J. Jeffrey Morris.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Barreto Filho, MM, Lu, Z., Walker, M. et al. Le contexte communautaire et la pCO2 impactent le transcriptome de la bactérie "helper" Alteromonas en co-culture avec des picocyanobactéries. ISME COMMUN. 2, 113 (2022). https://doi.org/10.1038/s43705-022-00197-2

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Reçu : 27 septembre 2022

Révisé : 25 octobre 2022

Accepté : 31 octobre 2022

Publié: 15 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s43705-022-00197-2

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