Modulation de la prolifération et de l'apoptose des cellules épithéliales intestinales par Lactobacillus gasseri SF1183

Apr 05, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 20248 (2022) Citer cet article

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Le microbiote intestinal exerce une variété d'effets positifs sur l'homéostasie intestinale, notamment la production de molécules bénéfiques, le contrôle de l'intégrité de la barrière épithéliale et la régulation de l'équilibre entre la mort et la prolifération des cellules de l'hôte. Les interactions entre les bactéries commensales et les cellules intestinales sont encore sous-étudiées et sont donc d'une importance primordiale pour aborder ces interactions aux niveaux moléculaire et cellulaire. Nous rapportons une analyse in vitro des effets de molécules sécrétées par Lactobacillus gasseri SF1183 sur des cellules HCT116, sélectionnées comme modèle de cellules épithéliales intestinales. SF1183 est une souche de L. gasseri isolée d'une biopsie iléale d'un volontaire humain sain, capable de prévenir les symptômes de la colite in vivo. En élargissant les découvertes précédentes, nous montrons que les molécules bioactives sécrétées par SF1183 réduisent la prolifération des cellules HCT116 de manière réversible en déterminant une variation des marqueurs du cycle cellulaire (p21WAF, p53, cycline D1) et entraînant la protection des cellules HCT116 contre le TNF-alfa induit. l'apoptose, un effet potentiellement pertinent pour la protection de l'intégrité de la barrière épithéliale et la reconstitution de l'homéostasie tissulaire. De manière constante, les molécules sécrétées par SF1183 augmentent le recrutement d'occludine, un composant majeur de la TJ, aux contacts cellule-cellule, suggérant un renforcement de la fonction barrière.

Le microbiote intestinal a co-évolué avec son hôte animal formant une relation symbiotique et contribuant à la santé métabolique de l'hôte. La distribution relative des bactéries intestinales est unique à un individu et change de manière transitoire en fonction du régime alimentaire, de l'âge, de l'exercice physique, de l'utilisation de médicaments et de la génétique de l'hôte, ce qui rend difficile la définition d'un microbiote normal ou sain. Cependant, une grande diversité de taxons, une grande richesse et des noyaux fonctionnels de microbiote stables caractérisent des communautés microbiennes intestinales saines1. Des altérations drastiques de cette composition microbienne (dysbiose) ont été associées à la pathogenèse de divers troubles métaboliques et maladies inflammatoires intestinales, y compris les inflammations du côlon (CU, colite ulcéreuse, MC, maladie chronique), généralement appelées maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les MII se caractérisent par une production anormale de cytokines inflammatoires (TNF-α, Tumor Necrosis Factor alpha, IFN-γ Interferon Gamma) par les cellules hôtes et une perturbation de l'intégrité épithéliale en partie due à une apoptose accrue. Afin d'équilibrer ces conditions, une série de stratégies d'intervention dirigées vers le microbiote ont été proposées et testées dans des modèles animaux et, dans certains cas, dans des essais humains. Il s'agit notamment de l'administration orale de (1) prébiotiques, oligosaccharides non digestibles (par exemple, inuline et oligofructose) qui, une fois fermentés par certains membres du microbiote, entraînent une amélioration des fonctions de barrière intestinale, (2) de probiotiques, bactéries vivantes qui, colonisant l'intestin exerce un effet bénéfique sur la santé (3) les symbiotiques, une combinaison de prébiotiques et de diverses souches de probiotiques ; et (4) postbiotiques, probiotiques pasteurisés ou parties de souches microbiennes1.

L'utilisation orale des probiotiques est actuellement très bien acceptée en raison de la capacité de certaines bactéries à influencer l'expression des cytokines, à réduire l'inflammation et à protéger l'intégrité de la barrière intestinale2,3,4,5,6. L'utilisation de probiotiques provient d'aliments traditionnels contenant des bactéries vivantes, courantes dans de nombreuses cultures et considérées comme ayant des effets bénéfiques sur la santé. Des exemples bien connus dans ce contexte sont les bactéries lactiques, présentes dans une variété d'aliments fermentés traditionnels7 et les formateurs de spores du genre Bacillus trouvés dans le Natto, un aliment sain traditionnel japonais à base de soja fermenté avec le B. subtilis var. natto et dans des aliments fermentés similaires traditionnellement utilisés dans divers pays8. Plusieurs espèces des genres Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus et Saccharomyces sont utilisées depuis longtemps comme probiotiques commerciaux8,9. De plus, d'autres bactéries intestinales ont été proposées comme probiotiques de nouvelle génération, telles que Faecalibacterium prausnitzii10 et Akkermansia muciniphila11.

Les mécanismes moléculaires contrôlant l'interaction entre les cellules intestinales et les bactéries ont été étudiés in vitro dans certains cas. Les exemples sont L. casei Shirota qui a des effets immunomodulateurs en induisant la production d'interleukine-12 (IL-12) ; L. fermentum NCIMB 5221 qui a un effet antiprolifératif et module l'hyperinsulinémie, la résistance à l'insuline, l'hypercholestérolémie et l'hypertriglycéridémie ; Saccharomyces cerevisiae var.boulardii qui a des effets anti-inflammatoires et antibactériens en augmentant la sécrétion d'immunoglobuline A (IgA) et en maintenant l'intégrité de la barrière épithéliale12. Souvent, il a été démontré que les autoinducteurs de détection de quorum, des molécules de communication libérées par les bactéries à haute densité, modulent les réponses de l'hôte soit directement, soit par la régulation des gènes bactériens. Des exemples dans ce contexte sont les peptides de détection de quorum de diverses espèces de Bacillus qui sont absorbés par les cellules intestinales et contribuent à l'homéostasie des cellules eucaryotes activant les voies de survie (p38 MitogenActivatedProteinKinase (MAPK) et protéine kinase B)13,14. Dans certains cas, les effecteurs bactériens sécrétés n'ont pas été identifiés : les molécules sécrétées par L. reuteri se sont avérées potentialiser l'apoptose induite par le facteur de nécrose tumorale (TNFα) dans les cellules dérivées de la leucémie myéloïde en supprimant l'activation du facteur nucléaire-kB (NF-kB) en inhibant la dégradation d'IkBa, en régulant à la baisse les produits géniques dépendants du facteur nucléaire kB (NF-kB) et en favorisant l'apoptose en améliorant les activités de MAPK, y compris la kinase c-Jun N-terminale et p38 MAPK15.

Dans ce contexte, notre étude étudie les effets in vitro de molécules bioactives produites et sécrétées par une souche de L. gasseri sur des cellules colorectales HCT116, tant au niveau moléculaire que cellulaire. L. gasseri est l'une des principales espèces de Lactobacillus homofermentaires de l'intestin humain et la souche SF1183 a été isolée à partir d'une biopsie iléale d'un volontaire humain sain16. En particulier, il a été isolé d'une sous-population de bactéries étroitement associées aux cellules épithéliales et s'est avéré avoir une activité antimicrobienne contre un panel d'entéropathogènes et former un biofilm en laboratoire standard ainsi que dans des conditions intestinales simulées16. Notre précédente étude in vivo a montré que le SF1183 a des effets protecteurs sur l'épithélium intestinal, renforçant les jonctions serrées et prévenant les symptômes de la colite induite par le Dextran-Sulfate-Sodium (DSS) sans effets majeurs sur la composition microbienne globale de l'intestin17.

Nous fournissons ici des preuves supplémentaires que L. gasseri SF1183 est capable d'influencer l'homéostasie de HCT116 en affectant la prolifération cellulaire de manière réversible, en réduisant l'apoptose induite par le TNF-α et en augmentant le recrutement d'occludine à la périphérie cellulaire. Nous avons caractérisé l'effet au niveau moléculaire et cellulaire montrant des altérations des marqueurs de prolifération cellulaire et des changements dans la forme cellulaire indiquant fortement un renforcement des fonctions barrières.

Pour étudier les effets des molécules sécrétées par L. gasseri SF1183 sur l'apoptose induite par les cytokines, la lignée cellulaire épithéliale intestinale HCT116 a été sélectionnée pour sa sensibilité au TNF-α18. Pour mettre en place les conditions expérimentales, différentes concentrations de TNF-α et différents temps d'incubation ont été utilisés pour traiter les cellules HCT116 (Fig. 1). L'induction du programme apoptotique a été suivie par l'analyse du clivage protéolytique de PARP-1 (Poly ADP-ribose polymérase 1) ; en particulier, la détection, par western blot, de la sous-unité catalytique PARP-1 (89 kDa) résultant de l'activité Caspase 3 a été utilisée comme marqueur apoptotique dans notre cadre expérimental. Comme prévu, les cellules HCT116 ont répondu au TNFα de manière dépendante de la dose et du temps (Fig. 1). Les conditions de TNF-α 1 nM pendant 8 h d'incubation ont été choisies pour les expériences ultérieures car elles ont déterminé un clivage partiel de PARP-1 permettant ainsi la détection de niveaux accrus ou diminués d'apoptose.

Les cellules HCT116 répondent à l'apoptose induite par le TNF-α (A) Les cellules HCT116 ont été incubées avec du TNF-α aux concentrations indiquées pendant 8 h. Les cellules ont été collectées et des extraits protéiques entiers ont été analysés par Western blot avec des anticorps contre la PARP-1 et la β-actine clivées. (B) Les cellules HCT116 ont été incubées avec TNF-α 1 nM pendant 1, 4 ou 8 h. Les cellules ont été collectées et des extraits de protéines entières ont été analysés par Western blot avec des anticorps contre la PARP-1 et la β-actine clivées.

Pour obtenir le milieu conditionné (CM) pour une analyse ultérieure, L. gasseri SF1183 a été cultivé jusqu'à la phase stationnaire, le milieu a été stérilisé par filtration puis ajouté (20 % v/v) aux cellules HCT116 pendant 16 h. Après cela, les cellules ont été incubées (Fig. 2, pistes 2 et 4) ou non (Fig. 2, pistes 1 et 3) avec 1 nM de TNF-α pendant 8 h sans retirer le CM. A la fin du temps d'incubation, les cellules ont été collectées, des extraits protéiques de cellules entières ont été préparés et analysés par western blot avec des anticorps spécifiques de la PARP-1 89 kDa clivée (Cell Signaling). Comme le montre la Fig. 2, le clivage protéolytique de PARP-1 (qui est détectable dans les cellules non traitées, voir voie 1) a été augmenté par le traitement au TNF-α (voies 1 vs 3) et fortement réduit en présence de CM à la fois dans les cellules traités ou non par TNF-α (pistes 1 vs 2 et 3 vs 4 ; p = 0,0002, p < 0,0001). La réduction de l'apoptose dans les cellules non traitées au TNF-α est remarquable et suggère un effet anti-apoptotique des molécules présentes dans le CM de L. gasseri également dans des conditions physiologiques de croissance dans lesquelles l'apoptose se produit à un niveau basal (Fig. 2, voies 1 contre 2). Aucune réduction de l'apoptose n'a été observée lorsque les cellules HCT116 ont été traitées avec un milieu bactérien frais acidifié à pH 4,0 avec de l'acide lactique, excluant la possibilité que l'effet observé avec le CM soit dû à l'acidification du milieu causée par la croissance fermentative de L. gasseri (données non présentées).

Le milieu conditionné de L. gasseri SF1183 réduit l'apoptose des cellules HCT116. (A) Les cellules HCT116 ont été incubées ou non avec CM pendant 16 h où indiqué ; après cela, les cellules ont été incubées avec du TNF-α 1 nM pendant 8 heures supplémentaires, le cas échéant. Les cellules ont été collectées et les extraits ont été analysés par Western blot avec des anticorps contre la PARP-1 et la β-actine clivées. (B) Quantification des niveaux de PARP-1 clivés normalisés à partir de trois répliques indépendantes réalisées par ImageLab. Les analyses statistiques ont été réalisées par test t non apparié. Les niveaux de signification sont indiqués (***p = 0,0002, **** p < 0,0001).

L'effet anti-apoptotique exercé par le CM était dû à une ou des molécules protéiques inférieures à 3 kDa dont la caractérisation est actuellement en cours (Fig. 1 supplémentaire).

Pour caractériser les effets exercés par le CM de L. gasseri SF1183 sur les cellules HCT116, nous avons effectué un test MTT pour analyser la viabilité des cellules HCT116 cultivées pendant 24 h en présence de CM. Comme le montre la figure 3A, le CM a provoqué une réduction de 30 % de la viabilité cellulaire (p < 0,0001). Une réduction similaire a été observée avec l'évaluation du nombre de cellules HCT116 mesuré dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l'expérience MTT (Fig. 3B ; p <0,0001), suggérant ainsi que la réduction de la viabilité était due à une réduction du nombre de cellules. et non de leur activité métabolique, permettant de faire l'hypothèse que le CM de L. gasseri contient des molécules capables d'inhiber la prolifération des cellules HCT116. Pour vérifier cette hypothèse, des analyses Western blot de biomarqueurs de la prolifération cellulaire ont été réalisées. Nous avons observé une induction drastique des marqueurs d'arrêt du cycle cellulaire p53 et p21WAF (augmentés d'environ 2,5 et 8 fois, respectivement ; 0,00482 ; p = 0,0088) et une réduction d'un marqueur de prolifération cellulaire (cycline D1) dans les cellules incubées avec CM pendant 24 h ( Fig. 3), soutenant pleinement notre hypothèse.

Le milieu conditionné de L. gasseri SF1183 réduit la prolifération des cellules HCT116. (A) Des cellules HCT116 en prolifération ont été incubées dans des milieux de culture cellulaire complets additionnés ou non de CM (20 % v/v) pendant 16 h ; après cela, les cellules ont été lavées du CM et traitées pour le test MTT. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un test t non apparié. Les niveaux de signification entre les points d'expression sont indiqués (**** p < 0,0001). (B) Des cellules HCT116 en prolifération ont été incubées dans des milieux de culture cellulaire complets additionnés ou non de CM (20 % v/v) pendant 16 h ; après cela, les cellules ont été lavées du CM. Après 24 h, les cellules ont été collectées et comptées. Les niveaux de signification entre les points d'expression sont indiqués (**** p < 0,0001). (C) Les cellules HCT116 en prolifération ont été incubées pendant 16 h dans des milieux de culture cellulaire complets additionnés de CM, le cas échéant ; après cela, les cellules ont été collectées, des extraits de cellules entières ont été préparés et analysés par western blot avec des anticorps contre p53, p21, cyclinD1, b-actine et Gapdh. (D) Quantification des niveaux de protéines normalisés à partir de trois répétitions indépendantes effectuées par ImageLab Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un test t non apparié. Les niveaux de signification entre les points d'expression sont indiqués (* p = 0,00482 ; ** p = 0,0088).

L'effet négatif du CM sur la prolifération des cellules HCT116 était partiellement réversible. Comme le montre la Fig. 4A, les cellules HCT116 cultivées en présence de CM pendant 16 h ont subi un arrêt de la prolifération cellulaire (carrés fermés sur la Fig. 4A) qui a été partiellement inversé lorsque le CM a été retiré, les cellules lavées et remises en suspension dans du milieu frais (carrés fermés sur la Fig. 4A). triangles sur la figure 4A) (p < 0,0001). La reprise partielle de la croissance cellulaire lors de l'élimination du CM a été confirmée par la réduction des niveaux intracellulaires de p53 et de p21WAF (Fig. 4B) induite par le traitement au CM. Au total, les résultats de la figure 4 indiquent que le CM de L. gasseri SF1183 a un effet réversible sur la prolifération des cellules HCT116.

Le milieu conditionné de L. gasseri SF1183 affecte la prolifération de HCT116 de manière réversible. (A) Courbe de croissance des cellules HCT116 soit cultivées dans un milieu complet (témoin, cercles) soit dans un milieu additionné de CM (carrés). Les cellules ont également été cultivées pendant 16 h en présence de CM ; après cela, les cellules ont été lavées du CM et laissées croître jusqu'à 24 h et 48 h au total (courbe avec triangles). Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA à 2 facteurs et du test de comparaison multiple de la Turquie. Niveaux de signification (**** p < 0,0001). (B) À 24 h de croissance, une aliquote de cellules a été collectée et des extraits de protéines entières ont été analysés par western blot avec des anticorps contre p53, p21 et Gapdh. Les intensités de bande ont été normalisées sur Gapdh de chaque blot et exprimées sous forme de rapport par rapport au contrôle.

Les éléments du cytosquelette influencent la formation des adhérences cellule-cellule et cellule-substrat, jouant ainsi un rôle crucial dans la formation d'une barrière gastro-intestinale saine dont les fonctions sont liées non seulement à l'absorption des nutriments, mais également à la protection contre les agents pathogènes et l'inflammation. Pour fonctionner correctement, l'épithélium intestinal nécessite d'être constitué d'une couche intacte de cellules et de jonctions qui scellent l'espace entre les cellules adjacentes. Il a été rapporté précédemment que L. gasseri SF1183 agit in vivo sur les jonctions serrées17. Par conséquent, nous avons décidé de caractériser la fonction de barrière potentielle exercée par CM en analysant le recrutement d'occludine aux contacts cellule-cellule. L'occludine est une protéine membranaire intégrale enrichie au niveau des jonctions serrées impliquée dans le maintien de l'intégrité structurale et des fonctions de barrière. Nous avons effectué des expériences d'immunofluorescence (IF) lors de l'incubation de CM (Fig. 5). Les cellules ont été autorisées à adhérer sur des lamelles pendant la nuit, traitées avec CM pendant 16 h comme d'habitude, fixées et soumises à IF avec anti-occludine, suivies de DAPI pour contrer la coloration des noyaux. De manière intéressante, nous avons observé un recrutement clair d'occludine aux contacts cellule-cellule des cellules traitées (Fig. 5 A comparer les panneaux supérieur et inférieur). Fait intéressant, une modification drastique de la morphologie cellulaire devient évidente lors du traitement, suggérant en outre un renforcement des jonctions serrées cellule-cellule. Remarquablement, comme le montre la figure 5B, le niveau total de protéines d'occludine n'a pas augmenté lors du traitement CM, soutenant ainsi l'hypothèse selon laquelle les molécules sécrétées pendant la croissance de L. gasseri induisent un renforcement des fonctions de barrière causées par la relocalisation de l'occludine à la périphérie cellulaire. Cette observation a conduit à l'hypothèse que la protection contre l'apoptose pourrait être due au renforcement des fonctions barrières provoquées par les molécules sécrétées lors de la croissance de L. gasseri.

Le milieu conditionné de L. gasseri SF1183 affecte HCT116 exerce un effet protecteur plus large sur les cellules HCT116. (A) Les cellules HCT116 ont été ensemencées sur des lamelles et traitées avec CM pendant 16 h, le cas échéant. Les cellules ont été fixées et analysées par IF avec anti-occludine, suivi de DAPI pour contrer la coloration des noyaux. Des images représentatives ont été prises avec un microscope confocal Zeiss. Barre d'échelle 5 μm. (B) Les cellules HCT116 ont été incubées avec CM 20 % v/v pendant 16 h. Les cellules ont été recueillies et les extraits ont été analysés par western blot avec des anticorps contre l'occludine et Gapdh.

L'équilibre entre la mort cellulaire et la prolifération est l'un des mécanismes homéostatiques les plus importants impliqués dans la santé des tissus, en particulier pour ceux caractérisés par un taux élevé de renouvellement cellulaire comme l'épithélium intestinal. À cet égard, les bactéries probiotiques, telles que les genres Lactobacillus et Bifidobacterium jouent des rôles importants, notamment la modulation de l'inflammation, la réduction du stress oxydatif et le contrôle de la prolifération cellulaire19,20,21,22,23. L'implication des bactéries commensales dans les maladies inflammatoires intestinales, connues sous le nom de MICI (maladie inflammatoire de l'intestin), y compris la CU (colite ulcéreuse) et la MC (maladies chroniques), est particulièrement intrigante. Dans certains cas, il a été démontré que les probiotiques provoquent la rémission de maladies inflammatoires également en influençant les niveaux de cytokines inflammatoires, exerçant ainsi un effet protecteur sur la barrière intestinale2,3,4,5,6,23. inflammations, est l'augmentation des cytokines inflammatoires qui, à leur tour, provoquent l'apoptose des cellules épithéliales avec perturbation de la barrière intestinale. D'autre part, la perte de l'intégrité épithéliale provoque l'infiltration d'aliments non digérés, de substances toxiques, de molécules bactériennes et de microbes dans la couche sous-muqueuse, augmentant encore l'inflammation locale ainsi que les effets systémiques. Parmi les cytokines les plus largement produites dans ces conditions se trouve le facteur de nécrose tumorale pro-inflammatoire alpha, TNF-α, connu pour jouer un rôle majeur dans le contrôle de l'équilibre entre la prolifération cellulaire et l'apoptose. Selon les conditions cellulaires, le TNF-α est capable de médier la survie ou la mort cellulaire24. L'intervention pharmacologique avec des traitements anti-TNFα (corticoïdes et/ou anticorps monoclonaux) constitue une approche thérapeutique potentielle dans les MII24, bien qu'un certain niveau de toxicité puisse être observé. Dans certains cas, les probiotiques ont été utilisés seuls25 ou en association avec des anticorps anti-TNF-α pour traiter l'inflammation intestinale26. Notre observation selon laquelle une souche de L. gasseri SF1183 est capable de protéger les cellules épithéliales intestinales de l'apoptose induite par le TNF-α est conforme à ces approches. Il convient de noter que cette souche est dérivée de l'intestin d'un individu en bonne santé, ce qui sous-tend ses avantages pour l'intestin ; d'autre part, L. gasseri est une espèce probiotique commune avec des effets connus sur la santé humaine27. De plus, la souche SF1183 s'est avérée capable d'exercer un effet protecteur dans un modèle murin de colite induite par le DSS (Dextran-Sulfate-Sodium) renforçant l'intégrité de la barrière intestinale sans altérer la composition de la microflore intestinale17. Nous ajoutons d'autres preuves sur les effets bénéfiques de la souche SF1183 donnant un aperçu aux niveaux cellulaire et moléculaire. Les molécules sécrétées par L. gasseri inhibent la prolifération cellulaire de manière réversible en agissant sur la voie p53/p21WAF. Bien que les mécanismes moléculaires précis ne soient pas connus, l'augmentation intracellulaire de p21WAF, un régulateur très connu de l'arrêt du cycle cellulaire28, pourrait représenter l'effecteur final de l'effet CM sur les cellules HCT116. D'autre part, p21WAF est également considéré comme un marqueur anti-apoptotique semblant jouer un rôle central en tant que modulateur de l'apoptose par divers mécanismes cellulaires29. Des résultats préliminaires sur les molécules potentiellement bioactives responsables dans la MC indiquent la présence de molécules de nature protéique, inférieures à 3 kDa. De tels métabolites, une fois identifiés et isolés, peuvent avoir des effets bénéfiques directs sur la santé et trouver une application en tant que postbiotiques30.

Fait intéressant, les cellules HCT116 traitées avec CM montrent un changement radical de la forme cellulaire avec une relocalisation claire de l'occludine à la périphérie cellulaire, indiquant un renforcement des jonctions serrées cellule-cellule. Des preuves in vivo antérieures sont conformes à cette observation étant donné que l'administration orale de L.gasseri SF1183 à des souris traitées au DSS montre une coloration claire de l'occludine sur la surface épithéliale similaire au témoin non traité, indiquant un épithélium reconstitué17. Bien que nos analyses aient été menées dans des conditions totalement différentes (sur des cellules humaines en culture incubées avec du milieu conditionné L. gasseri, c'est-à-dire avec des molécules potentiellement bioactives sécrétées), nos résultats actuels sont cohérents avec ceux précédemment obtenus in vivo. Fait intéressant, dans nos conditions, l'incubation avec CM ne provoque aucune augmentation des niveaux d'occludine mais plutôt une relocalisation aux contacts cellule-cellule.

La nature moléculaire des molécules sécrétées ainsi que les détails sur les voies moléculaires impliquées dans les effets observés seront des tâches difficiles à l'avenir. Toutes ces observations, ainsi que la réversibilité des effets exercés sur les cellules humaines, indiquent fortement que L. gasseri SF1183 est un outil thérapeutique sûr et prometteur pour améliorer les conditions inflammatoires intestinales.

La souche SF1183 Lactobacillus gasseri a été cultivée dans un bouillon MRS (Difco, Detroit, MI, USA) pendant 24 h à 37 °C et la culture diluée a été inoculée dans un milieu minimal défini (MDM ; Glucose 10 g/L, Acétate de sodium 5 g/ L, KH2PO4 3 g/L, K2HPO4 3 g/L, MgSO4 *7H2O 0,2 g/L, l-Alanine 100 mg/L, l-Arginine 100 mg/L, l-Aspartic acid 200 mg/L, l-Cysteine200 mg/L, l-Glutamique 200 mg/L, l-Histidine 100 mg/L, l-Isoleucine 100 mg/L, l-Leucine 100 mg/L, l-Lysine 100 mg/L, l-Méthionine 100 mg/ L, l-Phénylalanine 100 mg/L, l-Sérine 100 mg/L, l-Tryptophane 100 mg/L, l-Tyrosine 100 mg/L, l-Valine 100 mg/L, Acide nicotinique 1 mg/L, Acide pantothénique 1 mg /L, Pyridoxal 2 mg/L, Riboflavine 1 mg/L, Cyanocobalamine 1 mg/L, Adénine 10 mg/L, Guanine 10 mg/L, Uracile 10 mg/L). Les cellules de SF1183 ont ensuite été cultivées en anaérobiose pendant 48 h à 37 °C. La culture a été centrifugée (5000 g pendant 10 min à température ambiante (RT)) et le surnageant (milieu conditionné, CM) a été filtré-stérilisé à travers un filtre de liaison à faible teneur en protéines de 0, 22 μm (Millipore, Bedford, MA, USA).

Le côlon humain HCT116 (ATCC CCL-247) était un don du professeur Marina De Rosa, était cultivé en routine à 37 °C sous 50 % de confluence dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 dans du RPMI-1640 (Euroclone) additionné de 10 % (v /v) FBS (Euroclone), 1 % de pénicilline-streptomycine (Euroclone), 1 % de l-glutamine (Euroclone). Le CM bactérien a été testé à 10 % et 20 % de concentration v/v dans un milieu de croissance RPMI complet pendant 16 h. Cette dernière concentration a donné des résultats plus clairs dans la réduction du clivage de PARP-1 et a été sélectionnée pour toutes les expériences ultérieures ; Le MDM (milieu bactérien de croissance) a été utilisé à une concentration de 20 % v/v dans un milieu de croissance complet pour les échantillons témoins. Lorsque cela était indiqué, du TNF-α (1 nM) (Millipore, Milan, Italie) a été ajouté aux cellules sans retirer le CM et les cellules ont été récoltées après 8 h de traitement.

La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test MTT (Sigma-Aldrich). Il est basé sur la réduction du cycle tétrazolium du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) par des déshydrogénases mitochondriales, donnant un colorant violet (formazan), qui peut être mesuré spectrophotométriquement; la quantité de formazan produite est proportionnelle au nombre de cellules viables31. Les cellules HCT116 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (9 × 103 cellules/puits). Les cellules ont ensuite été traitées avec 20 % v/v CM comme décrit et incubées pendant 3 h à 37 °C avec une solution de MTT 1 × diluée dans du DMEM sans Phenol Red ; le surnageant a été éliminé et de l'isopropanol acide 0,01 N a été ajouté à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan insolubles formés. L'absorbance des échantillons a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (spectre Multiskan, Thermo)32.

Pour l'analyse de la prolifération cellulaire, les cellules HCT116 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une densité de 2,5 × 105 cellules/puits et incubées pendant 24 h en présence de 20 % v/v. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été collectées et le nombre de cellules dans chaque point expérimental a été compté avec le compteur Scepter-Millipore (Handheld Automated Cell Counter).

Pour l'analyse Western blot, les cellules ont été récoltées dans un tampon de lyse et traitées comme décrit33. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF, Millipore) à l'aide d'un appareil Mini trans-blot (Bio-Rad) selon les instructions du fabricant. La membrane a ensuite été incubée avec les anticorps indiqués. Les anticorps primaires étaient anti-lapin PARP-1 clivé (Cell signaling EuroClone, Milan, Italie 95415-S), anti-lapin p21WAF1 (Thermo Fisher, Invitrogen, Thermo Fisher Italie 14-671581), anti-lapin cycline D1 (SP4, Invitrogen , Thermo Fisher Italie, MA5-16356) β-actine anti-souris (C4 Santa-Cruz Biotechnology DBA Milan, Italie SC-47778), anti-souris Gapdh (6C5 Santa-Cruz Biotechnology DBA Milan, Italie, SC-32233), p53 anti-souris (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan MABE327). Les anticorps secondaires étaient anti-HRP de lapin (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan Italie 12-348) et anti-souris (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan Italie A9044). Les protéines ont été visualisées par chimiluminescence améliorée (ECL, Bio-Rad) et révélées par le logiciel Quantity One du système ChemiDoc TM XRS (Bio-Rad). Les intensités de bande ont été quantifiées par le logiciel ImageLab BioRad, normalisées par rapport aux contrôles de chargement et rapportées en tant qu'augmentation/réduction de pli par rapport à l'échantillon de contrôle. Des expériences représentatives sont présentées pour chaque transfert.

Les transferts originaux ont été recadrés pour éliminer les échantillons inutiles et sont affichés en tant que données brutes dans les informations supplémentaires.

Pour les expériences IF, les cellules ont été étalées dans des plaques à 24 puits à 105 cellules/puits, traitées avec CM 20 % v/v pendant 16 h et traitées comme décrit dans 34,35,36. En bref, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 % et incubées avec des anticorps anti-occludine (Invitrogen Thermo Fisher OC-3F10) 1:250 dans du PBS 1 × Tween 0,05 % suivi d'un anticorps secondaire anti-souris Cy3 conjugué (Invitrogen Thermo Fisher Colorant Alexa Fluor 488) 1:500 dans du PBS 1× Tween 0,05 %. Les images ont été prises avec un microscope confocal à balayage laser Axio Observer de Zeiss (Oberkochen, Allemagne). Un objectif 40 × a été utilisé et une analyse d'image a été effectuée à l'aide d'ImageJ34.

Toutes les données sont exprimées en tant que moyennes d'au moins trois répétitions biologiques ± erreurs standard (SE). L'analyse de la variance a été effectuée en utilisant une ANOVA unidirectionnelle ou par un test t non apparié à deux queues. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de Graph-Pad Prism (Graph-Pad Software).

Les données présentées dans cette étude sont disponibles dans le texte principal, les figures et le matériel supplémentaire.

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Cette recherche a reçu des fonds de l'Université de Naples de Federico II (Fonds MUR Ministero Università Ricerca-FRA Finanziamento della Ricerca di Ateneo 2021) et des fonds de recherche départementaux 2021 à AP et ER.

Département de biologie, Université Federico II, Naples, Italie

Blanda Di Luccia, Vittoria Acampora, Anella Saggese, Viola Calabrò, Maria Vivo, Tiziana Angrisano, Ezio Ricca & Alessandra Pollice

Département de médecine moléculaire et de biotechnologie médicale, Université Federico II, Naples, Italie

Loredana Baccigalupi

Département de chimie et biologie A. Zambelli, Université de Salerne, Salerne, Italie

Marie Vivo

Département de microbiologie et d'immunologie, Stanford University-School of Medicine, Stanford, Californie, États-Unis

Blanda Di Lucia

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BdL, VA et AS ont mené la plupart des expériences ; BdL et AS ont contribué à la production de CM ; MV a contribué à l'expérience IF et à la lecture critique du manuscrit ; VC et TA ont contribué à la conception d'expériences, à la discussion et à la lecture critique du manuscrit ; LB a contribué aux discussions, aux suggestions et à la rédaction de manuscrits ; AP et ER ont conçu les expériences, supervisé le projet et rédigé l'article. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Ezio Ricca ou Alessandra Pollice.

L'un des auteurs (E. Ricca) agit comme consultant pour Synergia Life Sciences (Inde) sur la commercialisation de souches probiotiques. Synergia Life Sciences (Inde) a acquis les droits commerciaux sur la souche utilisée dans cette étude (Lactobacillus gasseri SF1183) mais n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, dans la collecte, les analyses ou l'interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit .Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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Réimpressions et autorisations

Di Luccia, B., Acampora, V., Saggese, A. et al. Modulation de la prolifération et de l'apoptose des cellules épithéliales intestinales par Lactobacillus gasseri SF1183. Sci Rep 12, 20248 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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Reçu : 24 août 2022

Accepté : 16 novembre 2022

Publié: 24 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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