Altération de l'efflux Aβ et inflammation liée à l'accumulation cérébrovasculaire d'amyloïde

Apr 07, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 2 (2023) Citer cet article

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L'altération des voies vasculaires de l'élimination cérébrale de la β-amyloïde (Aβ) contribue à la maladie d'Alzheimer (MA). Les lésions vasculaires sont couramment associées au diabète. Ici, nous montrons dans des tissus humains et des rats modèles AD que le polypeptide amyloïde des îlots transmis par le sang (amyline) sécrété par le pancréas perturbe la clairance Aβ cérébrale. Les concentrations sanguines d'amyline sont plus élevées dans la MA que chez les personnes cognitivement non affectées. L'amyline formant de l'amyloïde s'accumule dans les monocytes circulants et co-dépose avec Aβ dans la microvasculature cérébrale, impliquant éventuellement une inflammation. Chez le rat, l'expression pancréatique de l'amyline humaine formatrice d'amyloïde induit en effet une inflammation cérébrovasculaire et des co-dépôts d'amyline-Aβ. Le transport d'Aβ médié par LRP1 à travers la barrière hémato-encéphalique et la clairance d'Aβ par le drainage du liquide interstitiel le long des parois vasculaires sont altérés, comme l'indique le dépôt d'Aβ dans les espaces périvasculaires. Au niveau moléculaire, les dépôts d'amyline cérébrovasculaires altèrent l'expression des gènes cérébraux immunitaires et liés à l'hypoxie. Ces données convergentes provenant d'humains et d'animaux de laboratoire suggèrent que la modification de l'amyline transmissible par le sang pourrait potentiellement réduire les dépôts d'amyline cérébrovasculaire et la pathologie Aβ.

La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par une surexpression et/ou une altération de la clairance de l'Aβ qui peut être liée à une prédisposition génétique précoce à la pathologie Aβ (MA familiale) ou survenir sporadiquement avec l'âge (MA sporadique)1. Les facteurs qui équilibrent l'élimination efficace par rapport à l'accumulation d'Aβ n'ont pas été entièrement définis. Les voies bien établies de clairance de l'Aβ cérébral comprennent le drainage du liquide interstitiel le long des parois des vaisseaux sanguins cérébraux, le transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) et le métabolisme par la microglie et les macrophages périvasculaires2,3,4.

L'amyline (également connue sous le nom de polypeptide amyloïde des îlots) est une hormone des cellules β pancréatiques co-libérée avec l'insuline5, traverse la BBB6 et est impliquée dans la régulation centrale de la satiété7. Chez les personnes atteintes de diabète sucré de type 2 (DM de type 2), l'amyline forme de l'amyloïde pancréatique8,9,10 (prévalence > 95 % à l'autopsie)10 et est associée à une inflammation pancréatique11,12,13. Les données de différentes équipes de recherche montrent que l'amyline co-agrège de manière synergique avec l'Aβ dans le tissu parenchymateux cérébral et se dépose également dans les artérioles et les capillaires cérébraux, dans les contextes de la MA sporadique et familiale14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24. Des concentrations plus élevées d'amyline dérivée du pancréas dans le système nerveux central sont associées à une fréquence accrue de troubles cognitifs21,22,23,24. Chez les rats APPswe/PS1dE9 (APP/PS1), l'expression pancréatique de l'amyline humaine (l'amyline des rongeurs n'est pas amyloïdogène) accélère les déficits comportementaux et les dépôts d'Aβ dans le cerveau21. Chez les rats sans pathologie Aβ (le rat HIP), l'expression pancréatique de l'amyline humaine formant de l'amyloïde favorise les dépôts cérébrovasculaires d'amyline entraînant une neuroinflammation18,25,26 et des déficits neurologiques18,21,25. Ces données constituent la base de notre hypothèse selon laquelle des concentrations accrues d'amyline formant de l'amyloïde dans le sang favorisent le dépôt d'amyline cérébrovasculaire et sont des facteurs contributifs essentiels à l'inflammation périvasculaire et à la clairance Aβ perturbée dans la MA. Pour déterminer une association potentielle entre l'amyline dérivée du pancréas dans le sang et l'altération de la clairance cérébrale de l'Aβ, nous avons mesuré les concentrations d'amyline dans le sang d'humains atteints de démence de type AD par rapport à des individus sans troubles cognitifs et évalué les relations avec l'Aβ parenchymateux et vasculaire cérébral. Pour comprendre le mécanisme et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire/prévenir le développement de la pathologie Aβ cérébrale, nous avons effectué des caractérisations physiopathologiques comparatives des voies de clairance Aβ cérébrales chez des rats transgéniques exprimant de l'amyline humaine formant de l'amyloïde dans le pancréas par rapport à des rats témoins qui expriment de l'amyline endogène, non -amyline de rat amyloïdogène. Les résultats de cette étude pourraient aider à mieux comprendre comment la modification de l'amyline transmissible par le sang peut être utilisée comme stratégie thérapeutique pour potentiellement réduire les dépôts d'amyline cérébrovasculaire et la pathologie Aβ.

L'hypothèse globale testée dans notre étude ainsi que le flux de travail et les méthodes sont décrits graphiquement dans les Fig. 1a, b. À l'aide d'ELISA, nous avons mesuré les concentrations d'amyline dans des échantillons de sang prélevés chez des personnes sans troubles cognitifs (CU ; n = 42) et des personnes atteintes de démence de type sAD (DEM ; n = 19) ou de troubles cognitifs légers (MCI ; n = 19) (voir tableau 1 pour les statistiques récapitulatives pour l'âge et le sexe). Les groupes avaient des concentrations de glucose sanguin similaires (112,9 ± 5,71 mg/dL contre 119,1 ± 9,43 mg/dL contre 113,2 ± 5,10 mg/dL ; ANOVA unidirectionnelle, P = 0,79) et l'âge (79,35 ± 2,18 ans contre 81,35 ± 1,78 ans contre 77,60 ± 0,66 ans ; ANOVA unidirectionnelle, P = 0,14). Les statistiques descriptives des concentrations d'amyline dans le sang sont présentées dans la Fig. S1a supplémentaire. Les concentrations d'amyline dans le sang étaient plus élevées dans les groupes DEM que dans les groupes CU (Fig. 1c) (analyse de variance unidirectionnelle de Kruskal-Wallis, P <0, 001). Dans les groupes divisés en fonction du statut de diabète de type 2, les concentrations sanguines d'amyline étaient très variables (Fig. S1b supplémentaire), ce qui peut refléter les effets des médicaments antidiabétiques. Un lien potentiel entre l'augmentation des concentrations d'amyline dans le sang et le diabète a été évalué plus en détail en mesurant la relation amyline-insuline dans les mêmes échantillons de sang que sur la figure 1c. Les tests ELISA d'insuline et d'amyline montrent que des concentrations accrues d'insuline dans le sang sont associées à des concentrations plus élevées d'amyline dans le sang (r = 0, 52; P <0, 0001) (Fig. 1d et Fig. Supplémentaire S1c). Le coefficient de corrélation par paires démontre que l'hyperamylinémie et l'hyperinsulinémie sont corrélées dans la MA.

Fonction putative d'amyline (panneau vert) et pathologie (panneaux rouges) (a) avec flux de travail et méthodes (b). c Concentrations d'amyline dans le sang chez les personnes atteintes de démence (DEM ; n = 19), de troubles cognitifs légers (MCI ; n = 19) et de personnes sans troubles cognitifs (CU ; n = 42). d Coefficient de corrélation par paires (r) entre les concentrations d'amyline et d'insuline dans les mêmes échantillons de sang qu'en (c). e Tri par cytométrie en flux des monocytes CD14+ circulant positifs (Q2) ou négatifs (Q1) à l'amyline dans le sang avec des concentrations d'amyline dans le quartile inférieur par rapport au quartile supérieur. f Images microscopiques confocales montrant l'amyline engloutie dans les monocytes CD14+ (n = 3). Coefficient de corrélation par paire (r) entre les concentrations d'amyline et d'Aβ42 dans le cerveau humain, y compris les personnes atteintes de sAD (n = 42) et sans AD (n = 18) (g), et entre la concentration d'amyline plasmatique ante mortem et la concentration d'amyline dans le tissu cérébral autopsié , y compris les personnes atteintes de sAD (n = 12) et sans AD (n = 8) (h) (les valeurs aberrantes potentielles ont été supprimées de l'analyse ; illustrées dans la Fig. S1e supplémentaire). i Analyse IHC utilisant des anticorps anti-amyline (marron) et anti-Aβ (vert) sur des coupes en série d'un cerveau sAD (n = 18). j Analyse microscopique confocale et test de ligature de proximité amyline-Aβ (PLA) montrant des dépôts vasculaires d'amyline-Aβ dans un cerveau sAD. Analyse IHC des cerveaux fAD montrant des dépôts d'Aβ dans les espaces périvasculaires et les parois vasculaires avec une accumulation d'amyline dans la lumière (k, l), et des dépôts d'amyline dans la paroi vasculaire (m) ou la paroi vasculaire (n), et des dépôts d'Aβ dans les espaces périvasculaires ( n = 32). Les données sont présentées sous forme de boîtes et de moustaches ou d'analyses de corrélation ; Kruskal-Wallis à sens unique de la variance, les données sont des moyennes ± SEM.

Étant donné qu'une sécrétion accrue d'amyline formant de l'amyloïde favorise l'accumulation d'amyline dans les macrophages et les cellules dendritiques des îlots pancréatiques11,12,13, nous avons émis l'hypothèse que des taux sanguins chroniquement élevés d'amyline déclenchent une inflammation systémique. En utilisant la cytométrie en flux, nous avons trié des fractions de monocytes CD14+ circulants positifs pour l'amyline. Nous avons quantifié les fractions de monocytes circulants positifs pour l'amyline (Q2) et ceux négatifs pour l'amyline (Q1) dans des échantillons de sang avec des concentrations d'amyline dans le quartile supérieur (>3,5 pM) et dans ceux avec des concentrations d'amyline dans le quartile inférieur (<1,5 pM) . Les échantillons de sang avec des concentrations d'amyline dans le quartile supérieur (> 3, 5 pM) contenaient des fractions accrues de monocytes CD14 + positifs pour l'amyline (Q2) (Fig. 1e). L'imagerie microscopique confocale a confirmé les inclusions d'amyline dans les monocytes CD14 + circulants (Fig. 1f).

Nous avons ensuite cherché à délimiter les associations possibles entre l'augmentation de la concentration d'amyline dans le sang et l'accumulation d'amyline et d'Aβ dans le cerveau. À l'aide d'ELISA, nous avons mesuré les concentrations d'amyline et d'Aβ42 dans des homogénats de cortex temporal de personnes atteintes de sAD identifiées par des caractéristiques neuropathologiques bien établies27,28,29,30,31 (n = 42 ; n = 22 avec un diabète de type 2) et d'individus sans pathologie sAD (n = 18 ; n = 6 avec DM de type 2) (voir Tableau 2 pour les données cliniques). Les individus sont d'âge similaire (85,65 ± 7,04 ans contre 87,22 ± 7,30 ans) dans les groupes sAD vs non-AD. Les concentrations d'amyline cérébrale étaient plus élevées chez les personnes de la sAD par rapport à celles du groupe témoin (test t non apparié, P <0, 01) (Fig. S1d supplémentaire), conformément aux résultats précédents d'autres cohortes15,21. Il n'y avait aucune différence dans les niveaux d'amyline cérébrale entre ceux atteints de diabète de type 2 et ceux qui n'en avaient pas (Fig. S1e supplémentaire); cependant, l'analyse n'a pas contrôlé les effets potentiels des médicaments glycémiques ni les médicaments administrés aux personnes atteintes de troubles cognitifs. Des concentrations accrues d'amyline cérébrale étaient associées à des concentrations plus élevées d'Aβ42 (r = 0, 34; P <0, 05) (Fig. 1g), ce qui correspond à la relation amyline-Aβ42 récemment identifiée dans les cerveaux fAD21. En utilisant des homogénats de plasma et de tissu cérébral appariés qui étaient disponibles dans cette cohorte (n = 12 dans le groupe sAD n = 8 témoins), nous avons évalué la relation entre les concentrations d'amyline plasmatique ante mortem et les concentrations d'amyline dans le tissu cérébral autopsié. Le coefficient de corrélation par paire suggère une relation possible entre les niveaux d'amyline en circulation et la propension de l'amyline à s'accumuler dans le cerveau (r = 0,40 ; P = 0,09) (Fig. 1h) (l'analyse a exclu les valeurs aberrantes potentielles des concentrations d'amyline dans les tissus cérébraux ; Fig. S1e). La petite taille de l'échantillon d'échantillons de plasma et de cerveau appariés est une limitation.

Pour tester le chevauchement potentiel de l'amyline et de l'Aβ au niveau de la BHE, nous avons analysé les cerveaux sAD et fAD pour des preuves histologiques de la co-localisation vasculaire de l'amyline-Aβ en utilisant l'immunohistochimie (IHC), la microscopie confocale et le test de ligature de proximité (PLA) avec anti-amyline et anticorps anti-Aβ. Pour la déconvolution et l'analyse des signaux d'intensité de l'immunoréactivité de l'amyline sur les images IHC, le tissu pancréatique d'un patient atteint de diabète de type 2 a servi de témoin positif pour le dépôt d'amyline (Fig. S1f supplémentaire). L'analyse histopathologique de la co-localisation cérébrovasculaire amyline-Aβ est résumée dans le tableau 3. Images représentatives de la coupe en série et de la coloration IHC avec des anticorps anti-amyline, anti-Aβ et anti-amyline et anti-Aβ combinés dans les tissus du cortex temporal d'un 83- Une femme âgée de 12 ans atteinte de TSA et de diabète de type 2 est illustrée à la Fig. 1i. L'analyse microscopique confocale et le PLA avec les mêmes anticorps anti-amyline et anti-Aβ ont confirmé le dépôt cérébrovasculaire d'amyline-Aβ (Fig. 1j). Le signal PLA montre une cohérence globale avec la colocalisation amyline-Aβ apparaissant dans la paroi artériolaire. À titre de comparaison, les images de l'analyse IHC du tissu du cortex temporal d'une femme de 86 ans sans troubles cognitifs sans diabète de type 2 sont présentées dans la Fig. S1g supplémentaire. Dans la Fig. 1k – n et les Figs supplémentaires. S1h, nous présentons des exemples supplémentaires de co-localisation cérébrovasculaire de l'amyline-Aβ à partir d'analyses IHC dans un sous-ensemble de cerveaux de patients atteints de fAD et avec une accumulation documentée d'amyline par IHC et ELISA21. Les dépôts d'Aβ sont présents dans les espaces périvasculaires et les parois artérielles, tandis que l'amyline semble s'accumuler dans la lumière (Fig. 1k, l), la paroi artérielle (Fig. 1m) et du côté luminal (Fig. 1n). L'analyse IHC a détecté de l'amyline dans environ 2/3 des vaisseaux sanguins totaux colorés positifs pour Aβ dans les cerveaux fAD (tableau 3). L'analyse microscopique confocale de la section du cerveau triplement colorée avec des anticorps d'actine anti-amyline, anti-Aβ et anti-α des cellules musculaires lisses (SMC) soutient en outre les schémas de co-localisation dans lesquels l'Aβ est présent dans les zones périvasculaires et l'amyline dans la paroi des vaisseaux sanguins (Fig. S1i supplémentaire).

Nos données montrent une accumulation d'amyline formant de l'amyloïde pancréatique dans le sang et les monocytes circulants, et de l'amyline co-localisée avec l'Aβ dans le système vasculaire cérébral, chez les personnes atteintes de MA. Les résultats suggèrent l'hypothèse selon laquelle des concentrations accrues d'amyline formant de l'amyloïde dans le sang perturbent l'efflux cérébral d'Aβ, impliquant peut-être une inflammation.

Nous avons utilisé des rats chez lesquels les cellules β pancréatiques expriment l'amyline humaine (le modèle de rat HIP18) et des rats de type sauvage (WT) exprimant l'amyline de rat endogène non amyloïdogène, pour déterminer les effets potentiellement causaux de l'augmentation des concentrations d'amyline humaine formant de l'amyloïde dans le sang sur le développement de l'inflammation systémique et cérébrovasculaire. La spécificité de l'expression de l'ARN d'amyline humaine dans le pancréas et l'absence d'ARN d'amyline humaine dans le cerveau chez les rats HIP ont été documentées par qRT-PCR, comme indiqué précédemment25. Des rats HIP mâles et femelles développent un diabète de type 2 associé à un dépôt amyloïde d'amyline pancréatique18,32 à une dérégulation du glucose18,32 et à des déficits neurologiques18,25. La dérégulation du glucose et les déficits comportementaux se développent plus tard (à environ 6 mois) chez les rats femelles et mâles HIP, comme nous l'avons signalé précédemment18. Les concentrations d'amyline sanguine augmentent avec une glycémie plus élevée (Fig. 2a). À l'âge auquel les rats HIP développent des déficits neurologiques (~ 16 mois) (Fig. S2 supplémentaire), les concentrations sanguines d'amyline chez les rats mâles HIP se situaient dans la même fourchette que chez les personnes présentant un déclin cognitif (Fig. 2b).

a Concentrations transversales d'amyline et de glucose dans le sang chez des rats HIP âgés de 6 à 8 mois (n = 6), de 10 à 12 mois (n = 13) et de 15 à 16 mois (n = 12). b Concentrations sanguines d'amyline chez les humains atteints de démence (DEM) par rapport aux rats HIP ; mêmes rats que dans (n ​​= 16) (a). c Tri par cytométrie en flux des monocytes CD14+ circulants positifs pour l'amyline dans le sang des mêmes rats qu'en (b) (n = 10 mâles/groupe). d Images microscopiques confocales de monocytes circulants colorés pour le CD14+ (rouge) et l'amyline (vert) dans le sang des mêmes rats qu'en (b) (n = 5 échantillons de sang/groupe). e Interleukine (IL)-1β ELISA dans le plasma de rats HIP vs WT similaires aux groupes de (b) (n = 10 mâles/groupe). f Images microscopiques confocales montrant des dépôts d'IL-1β et d'amyline dans les vaisseaux sanguins du cerveau chez les rats étudiés en (b) (n = 3 mâles/groupe). g Analyse IHC de coupes cérébrales de rats HIP et WT des mêmes groupes qu'en (c) montrant des dépôts vasculaires d'amyline (marron) et des réactions astrogliales (taches vertes pour la protéine acide fibrillaire gliale ; GFAP) (n = 5 mâles/groupe) . Analyse IHC de la microglie phagocytaire (CD68) (h) et du recrutement de monocytes vasculaires (CD11b) (i) dans des coupes de cerveau de rats HIP vs WT des mêmes groupes qu'en (b) (n = 10 mâles/groupe). Les données sont des moyennes ± SEM ; test t non apparié pour tous les panels.

En utilisant la cytométrie en flux, nous avons trouvé un nombre plus élevé de monocytes CD14 + et de monocytes CD14 + positifs à l'amyline dans le sang des rats HIP par rapport à ceux dans le sang des compagnons de litière WT (Fig. 2c). Comme dans le sang humain de personnes atteintes de MA (Fig. 1f), l'imagerie microscopique confocale des monocytes circulants colorés pour CD14 + (présente également des dépôts d'amyline (Fig. 2d).

L'amyline formant de l'amyloïde pancréatique active l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages et les cellules dendritiques, entraînant la maturation de l'interleukine (IL)-1β et l'inflammation des îlots pancréatiques11,12,13. La concentration de cytokine pro-inflammatoire IL-1β dans le plasma était plus élevée chez les rats HIP que chez les compagnons de litière WT (Fig. 2e). Cela a été associé à une intensité accrue du signal d'immunoréactivité de l'IL-1β dans les parois des vaisseaux sanguins du cerveau du rat HIP (Fig. 2f), conformément aux données précédemment publiées de l'analyse de l'IL-1β dans le tissu parenchymateux du cerveau du rat HIP25,26. En utilisant l'IHC avec des anticorps anti-amyline et anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), nous avons détecté une réaction astrogliale induite par l'amyline cérébrovasculaire dans le cerveau des rats HIP (Fig. 2g). Cela semble être associé au recrutement vasculaire de monocytes et de macrophages, comme suggéré par l'IHC avec des anticorps contre le cluster de différenciation (CD) 68 et CD11b (Fig. 2h, i). Ces résultats indiquent une exposition chronique à l'amyline formant de l'amyloïde sécrétée par le pancréas comme déclencheur d'une inflammation cérébrovasculaire systémique et locale.

L'intensité du signal de fluorescence de la thioflavine T (ThT) dans les lysats sanguins était plus élevée chez les rats HIP que chez les compagnons de litière WT (Fig. 3a), indiquant une accumulation d'amyline formant de l'amyloïde dans le sang. À l'aide d'ELISA, nous avons constaté une augmentation des concentrations d'amyline dans les lysats de microvaisseaux cérébraux de rat HIP par rapport aux lysats de microvaisseaux cérébraux de compagnons de litière WT, âgés de 16 mois (Fig. 3b). La co-coloration de tranches de cerveau de rats HIP et WT avec des anticorps anti-Aβ et anti-amyline a détecté un dépôt vasculaire d'amyline-Aβ chez les rats HIP (Fig. 3c). Dans les cerveaux de rats HIP, l'immunoréactivité de l'amyline a été détectée du côté luminal du vaisseau sanguin, souvent avec Aβ dans les espaces périvasculaires et dispersés à travers le tissu parenchymateux.

a Intensités du signal de fluorescence de la thioflavine T (Th T) dans les lysats sanguins de rats HIP et de compagnons de litière WT (âgés de 15 à 16 mois ; n = 10 mâles/groupe). b Concentrations d'amyline dans les lysats de microvaisseaux cérébraux chez les rats HIP et WT similaires à celles de (a) (n = 10 mâles/groupe). c Analyse IHC de cerveaux de rats HIP montrant des dépôts d'Aβ (vert) dans les espaces périvasculaires et une accumulation d'amyline (marron) dans la lumière. (n = 5 hommes/groupe ; âgés de 15 à 16 mois). d Intensités moyennes du signal de fluorescence de la thioflavine T (Th T) dans les lysats sanguins des compagnons de litière APP/PS1/HIP et APP/PS1 âgés de 15 à 16 mois (n = 10 rats mâles/groupe). e Concentrations d'amyline dans les lysats de microvaisseaux cérébraux des mêmes rats que ci-dessus. f Micrographies IHC représentatives de coupes cérébrales de rats APP/PS1/HIP et APP/PS1 co-colorées avec des anticorps anti-amyline (marron) et anti-Aβ (vert) (n = 5 mâles/groupe ; âge 15-16 mois ) (3 lames/cerveau). Images représentatives de l'IHC et analyse de la microglie phagocytaire (CD68) (g) et du recrutement de monocytes vasculaires (CD11b) (h) dans des coupes de cerveau de rats mâles APP/PS1/HIP vs APP/PS1 (n = 10 mâles/groupe ; âge 16- mois). Les données sont des moyennes ± SEM ; test t non apparié pour tous les panels.

Nous avons en outre utilisé des rats APP/PS1 avec expression pancréatique de l'amyline humaine (rats APP/PS1/HIP) pour étudier l'impact de l'amyline humaine formant de l'amyloïde pancréatique sur l'Aβ cérébrovasculaire dans le cadre d'une pathologie de type MA. Les rats APP/PS1/HIP développent des dépôts d'amyline-Aβ dans le cerveau21. Par rapport aux compagnons de portée APP / PS1, les rats APP / PS1 / HIP ont une intensité de signal Th-T accrue dans les lysats sanguins (Fig. 3d) et une accumulation d'amyline dans les microvaisseaux cérébraux (Fig. 3e). L'IHC avec des anticorps anti-Aβ (vert) et anti-amyline (marron) a révélé des zones de tissu vasculaire de co-localisation de l'amyline-Aβ dans les cerveaux de rat APP / PS1 / HIP, alors que les compagnons de la même portée APP / PS1 n'avaient pas de dépôts cérébrovasculaires d'amyline-Aβ (Fig. .3f). Ceci était associé au recrutement vasculaire de monocytes et de macrophages, comme indiqué par l'IHC avec des anticorps contre CD68 et CD11b (Fig. 3g, h), similaire à l'inflammation cérébrovasculaire démontrée chez les rats HIP (Fig. 2h, i).

Nos résultats montrent que l'apparition tardive de déficits neurologiques chez les rats présentant une expression pancréatique spécifique de l'amyline humaine (Fig. 2 supplémentaire) est associée au dépôt d'amyline dans les artérioles cérébrales (y compris les co-dépôts avec Aβ) (Fig. 3c, f) et dans les capillaires (Fig. 2b, e), et avec le développement d'une inflammation systémique et cérébrovasculaire (Fig. 2 et 3g, h). Ces résultats reproduisent nos découvertes chez l'homme (Fig. 1).

L'altération du drainage du liquide interstitiel dans le cerveau est indiquée par la présence de dépôts Aβ périvasculaires (comme sur la Fig. 3c, f) et est attribuée à des altérations de la contractilité et de la relaxation des SMC vasculaires2,3,4. L'homéostasie endothéliale de l'oxyde nitrique (NO)-arginase, un médiateur du tonus vasculaire myogénique33, est altérée chez les rats HIP et est associée à un dysfonctionnement endothélial34. Nous avons utilisé des expériences de débit sanguin cérébral (CBF), de myographie de pression et de stress oxydatif SMC vasculaire chez des rats HIP versus WT pour tester une association possible entre des concentrations accrues d'amyline formant de l'amyloïde dans le sang et une altération de la vasodilatation cérébrale.

Les mesures longitudinales d'IRM cérébrale ont révélé des altérations structurelles cohérentes qui progressaient plus rapidement avec le vieillissement chez les rats HIP par rapport aux rats WT (Fig. 4a). La perfusion cérébrale a été évaluée à l'aide d'un marquage de spin artériel pseudo-continu (ASL)35. Les résultats montrent une réduction du CBF chez les rats HIP, âgés de 15 à 16 mois (Fig. 4b). Les concentrations plasmatiques de nitrite et de nitrate (produits finaux stables de NO) ont augmenté chez les rats HIP par rapport aux rats WT, âgés de 15 à 16 mois (Fig. 4c), probablement en raison d'une inflammation systémique chez les rats HIP (comme le suggèrent les données de la Fig. 2). Des expériences de myographie de pression utilisant des artères piales isolées démontrent que les artères WT et HIP développent un tonus artériel36 (par exemple, une constriction induite par la pression) (Fig. 4d) ; cependant, les artères des rats HIP présentent un tonus artériel élevé par rapport aux rats WT avec une augmentation de la pression intravasculaire (par exemple, 60 à 100 mmHg) (Fig. 4d, e). Pour vérifier davantage l'altération du tonus artériel induite par l'amyline, nous avons utilisé des artères cérébrales isolées de rats WT et de rats knock-out d'amyline (AKO), et de rats AKO injectés par voie intraveineuse avec de l'amyline humaine formant de l'amyloïde à un régime qui reproduit l'intensité du signal d'immunoréactivité à l'amyline mesurée dans le plasma humain18 (c.-à-d. 60 µg/kg de poids corporel ; injection intraveineuse quotidienne dans la veine de la queue pendant 1 semaine). Le tonus artériel est similaire dans les artères cérébrales des rats WT et AKO (Fig. 4f); cependant, le tonus artériel était élevé dans les artères de rats injectés avec de l'amyline humaine (Fig. 4f). Ces résultats suggèrent un effet direct de l'amyline sur l'altération du tonus artériel. Conformément à ces résultats, les CML vasculaires de rats HIP présentent une peroxydation lipidique accrue (Fig. 4g, h), qui se produit également dans les CML incubées avec de l'amyline humaine exogène (Fig. Supplémentaire S3a, b).

a IRM pondérée en T2 et volumes d'hyperintensité ventriculaire longitudinale chez les rats HIP vs WT (n = 4–5 mâles/groupe). b Cartes CBF et CBF global chez les rats HIP et WT, âgés de 15 à 16 mois (9 mâles/groupe). c Concentrations transversales de nitrite et de nitrate plasmatiques chez les rats HIP et WT (n = 6 mâles/groupe/âge). Traces de diamètre dans les artères piales des rats mâles HIP et WT à différentes pressions intravasculaires (d), et tonus artériel des artères piales (e) mesuré à la pression intravasculaire indiquée (2–3 artères/rat, n = 6–7 mâles/groupe , âge 15-16 mois). f Identique à (e) dans les artères cérébrales postérieures des rats WT et amylin knock-out (AKO), et chez les rats AKO injectés par voie intraveineuse avec de l'amyline humaine (n = 3 mâles/groupe, âgés de 9 à 10 mois). g, h Peroxydation lipidique dans les CML de l'artère piale de rats mâles WT et diabétiques HIP mesurée avec Liperfluo (g ; N = 62 CML de 4 rats WT et 70 cellules de 4 rats HIP) et C11-BODIPY581/591 (h ; N = 87 SMC de 7 rats WT et 68 cellules de 4 rats HIP). i Activité de l'arginase et concentrations d'arginase-1 et d'arginase-2 dans les lysats de microvaisseaux cérébraux HIP vs WT (n = 7 hommes/groupe ; 15 à 16 mois). j Mécanisme proposé : des concentrations chroniquement accrues d'amyline formant de l'amyloïde pancréatique dans le sang provoquent un stress oxydatif dans la paroi vasculaire, entraînant une dérégulation de la NO-arginase et une altération de la fonction SMC et du tonus myogénique. Les données sont des moyennes ± SEM. Test non paramétrique de Mann–Whitney pour les panels (g, h), test t non apparié pour les autres panels.

L'augmentation de la peroxydation lipidique contribue au stress oxydatif dans la paroi vasculaire et réduit la biodisponibilité du NO, altérant la fonction vasodilatatrice. L'activité et l'expression de l'arginase ont été augmentées dans les lysats microvasculaires cérébraux de rats HIP par rapport à ceux de la même portée WT (Fig. 4i), suggérant une dérégulation de l'arginase-NO (Fig. 4j; mécanisme proposé). Un impact possible de l'augmentation de la concentration d'amyline dans le sang sur la régulation de l'arginase-NO cérébrovasculaire a été testé plus avant dans des lysats microvasculaires cérébraux de rats injectés par voie intraveineuse avec de l'amyline humaine formant de l'amyloïde (Fig. S3c supplémentaire).

Pris ensemble, nos résultats indiquent que les dépôts périvasculaires d'Aβ chez les rats HIP et APP / PS1 / HIP (Fig. 3c, f) sont potentiellement liés à une contraction / relaxation spontanée altérée des CML cérébrovasculaires causée par le développement d'une vasculopathie à l'amyline.

Les analyses Western blot de l'Aβ dans les homogénats de tissus cérébraux (Fig. 5a) et l'analyse Western blot de l'Aβ enrichi par immunoprécipitation dans le plasma et les homogénats cérébraux (Fig. 5b) montrent le dépôt cérébral d'Aβ chez les rats HIP, même en l'absence de surexpression d'Aβ induite génétiquement. (c'est-à-dire, comme chez les rats APP/PS1). Le rapport des niveaux plasmatiques d'Aβ au cerveau était inférieur chez les rats HIP par rapport aux rats WT, ce qui suggère une altération potentielle du transport d'Aβ du cerveau au sang. Dans ces expériences, nous avons utilisé des homogénats de cerveau d'un rat APP/PS1 âgé de 12 mois comme témoins positifs pour l'accumulation d'Aβ dans le cerveau.

a Analyses par Western blot du tissu cérébral Aβ chez des rats WT et HIP (n = 4–5 mâles / groupe; âgés de 15 à 16 mois) avec un homogénat de cerveau de rat Aβ40 et APP / PS1 utilisé comme contrôle positif pour le signal d'immunoréactivité Aβ. b Efflux estimé d'Aβ cérébral par immunoprécipitation et analyses Western blot d'Aβ dans le plasma et les homogénats de cerveau de rats WT et HIP (similaires à ceux de a), avec un homogénat de cerveau de rat APP / PS1 utilisé comme contrôle positif pour le signal d'immunoréactivité Aβ. c Action d'amyline proposée sur le transport Aβ à travers la BHE. d Microscopie confocale et analyse STORM de l'amyline dans les microvaisseaux cérébraux isolés de rats HIP (n = 47 microvaisseaux) et WT (n = 21 microvaisseaux) (n = 3 mâles/groupe; âgés de 15 à 16 mois). Analyse par microscopie confocale de coupes en série de cerveaux de rats HIP colorés avec de la thioflavine S (Thio S) ou de l'amyline (e) et avec le marqueur de peroxydation lipidique 4-HNE ou de l'amyline (f) (n = 3 mâles similaires à ceux de d). Analyse par Western blot de la P-gp (g) et de la LRP1 (h) dans les lysats de microvaisseaux cérébraux de rats HIP et WT (n = 5–7 mâles/groupe similaires à ceux de a), et dans les EC microvasculaires cérébraux incubés avec de l'amyline humaine. Les données sont des moyennes ± SEM.

Le transport Aβ à travers la BHE est médié par la protéine 1 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité (LRP1), un récepteur de l'apolipoprotéine E (APOE)37,38,39. Au niveau de la BHE, LRP1 se lie à Aβ du côté cérébral de l'endothélium, facilitant la libération de Aβ dans la circulation systémique (Fig. 5c). P-glycoprotéine 1 (P-gp; également connue sous le nom de membre 1 de la sous-famille B de la cassette de liaison à l'ATP; ABCB1), une pompe à efflux dépendante de l'ATP, médie la libération d'Aβ du côté sanguin de la BBB40,41. L'ApoA-I stabilise la P-gp dans les cellules endothéliales (CE)42,43 et se lie à l'amyline chez les rats HIP, comme nous l'avons décrit dans notre étude précédente18. Ici, nous avons mesuré les associations de dépôt d'amyline cérébrovasculaire avec des altérations médiées par le stress EC dans l'expression des protéines LRP1 et P-gp dans la microvasculature cérébrale du rat HIP. La microscopie confocale et l'analyse des dépôts d'amyline à l'aide de l'imagerie à super-résolution par microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ont montré la juxtaposition des signaux d'intensité optique de l'amyline et de la cavéoline-1 (Fig. 5d), confirmant le dépôt d'amyline dans les capillaires cérébraux du rat HIP (voir Fig. 3b). ). Le dépôt d'amyline dans les capillaires cérébraux a les propriétés biochimiques de l'amyloïde (Fig. 5e) et déclenche l'accumulation du marqueur de peroxydation lipidique 4-hydroxynonenal (4-HNE) (Fig. 5f) démontrant le stress oxydatif induit par l'amyloïde dans la BHE. Cela a été associé à des niveaux de protéines P-gp et LRP1 régulés à la baisse, comme indiqué par l'analyse Western blot de ces protéines dans les lysats capillaires cérébraux de rats HIP et WT et dans les lysats d'EC incubés avec de l'amyline humaine formant de l'amyloïde (Fig. 5g, h) .

Pour déterminer si l'amyline formant de l'amyloïde peut influencer directement l'efflux d'Aβ par l'intermédiaire de LRP1, nous avons utilisé un modèle in vitro de BBB dans lequel la monocouche EC a été exposée à de l'amyline humaine formant de l'amyloïde du côté luminal et de l'Aβ à l'abluminal (côté cerveau). ), comme le montre la figure 6a. Le modèle BBB a été testé pour la formation de monocouche en mesurant la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) (Fig. 6b). Toutes les expériences ont été réalisées avec une monocouche EC entièrement formée caractérisée par le maximum TEER = 110 ± 5 Ω/cm2. La dose-réponse des EC microvasculaires cérébraux à l'incubation avec diverses concentrations d'amyline humaine pendant 24 h est illustrée à la Fig. 6c. Les niveaux de protéine LRP1 ont diminué avec l'augmentation des concentrations d'amyline humaine ; L'expression de LRP1 a été réduite de plus de 50 % dans les CE incubées avec 10 µM d'amyline humaine (Fig. 6c). La viabilité de la CE n'a pas été affectée par l'incubation avec de l'amyline humaine (Fig. 6d), ce qui indique que la diminution de l'expression de la protéine LRP1 n'est pas due à la mort cellulaire. Ensuite, nous avons appliqué le peptide d'amyline humaine (10 μM) ou le véhicule du côté luminal (sang) pendant 24 h, suivi d'un lavage des monocouches EC avec du PBS et de l'application de FITC-Dextran ou d'Aβ42 marqué à la carboxyfluorescéine (Aβ42-FAM) au niveau abluminal (cerveau ) du côté du BBB pendant 1 heure. Les quantités d'Aβ42-FAM et de FITC-Dextran qui ont traversé la monocouche ont été estimées à partir de l'intensité de fluorescence dans les échantillons de milieu prélevés du côté luminal et utilisées pour calculer le quotient de transcytose Aβ. Le prétraitement à l'amyline a réduit le quotient de transcytose Aβ de 20 ± 5% (P <0, 05) (Fig. 6e).

a Représentation en dessin animé du modèle BBB in vitro (monocouche ECs - chambre luminale ; astrocytes - chambre abluminale) utilisé dans les expériences de transcytose Aβ. b Résistance électrique transendothéliale (TEER) dans les monocouches EC (n = 20 préparations) en fonction des jours de culture. c Western blot représentatif et quantification par densitométrie de LRP1 dans des lysats de CE vasculaires microvasculaires primaires de cerveau de rat traités avec un véhicule ou diverses concentrations d'amyline humaine (500 nM, 1 µM, 5 µM et 10 µM) pendant 24 h (n = 3 préparations/ test). d Pourcentage de viabilité cellulaire à partir du test MTS dans les EC traités avec de l'amyline humaine formant de l'amyloïde (500 nM, 1 µM, 5 µM et 10 µM) ou un véhicule, pendant 24 h. e Le quotient de transcytose Aβ42 (TQ) à travers la BBB in vitro, dans des monocouches EC traitées avec un véhicule et de l'amyline humaine. f Niveaux d'ARNm de LRP1 (différence multipliée par la méthode 2-ΔΔCt) mesurés avec qRT-PCR dans des lysats de CE traités avec un véhicule, de l'amyline humaine ou de l'amyline de rat. g Niveaux d'ARNm de LRP1 mesurés par qRT-PCR dans les lysats capillaires cérébraux des mêmes rats que sur la Fig. 5h. h, i niveaux d'expression de miARN (miR) -103 et miR-107 mesurés par qRT-PCR dans des lysats de CE traités avec un véhicule ou de l'amyline humaine (identique à la Fig. 5h), et dans des lysats capillaires cérébraux de mêmes rats que dans la Fig. 5h. j Schéma TargetScan montrant les régions consensus pour miR-205, miR200bc-3p/429 et miR-103 et miR-107. Analyses Western blot de LRP1 à partir de miARN (miR) 103 et miR-107 CE traités par rapport au contrôle miR (n = 3 préparations/groupe) (k), ainsi que de LRP1 (l) et P-gp (m) de antagomir (amiR) 103 et amiR-107 CE traités par rapport aux cellules traitées amiR-contrôle (n = 3 préparations/groupe). Les données sont moyennes ± SEM. ANOVA unidirectionnelle avec post hoc de Dunnett (F). test t non apparié pour les autres panels.

Dans les CE incubées avec 10 µM d'amyline humaine formant de l'amyloïde pendant 24 h, les niveaux d'ARNm de LRP1 étaient élevés par rapport aux CE témoins (traitées avec le véhicule) et aux CE incubées avec la même concentration d'amyline de rat (Fig. 6f). Les niveaux d'ARNm de LRP1 ont augmenté dans les lysats capillaires cérébraux HIP vs WT (Fig. 6g). Pris ensemble, les résultats indiquent que l'amyline formant de l'amyloïde peut influencer directement l'efflux d'Aβ en supprimant l'expression de la protéine de transport à un niveau post-transcriptionnel.

Les données publiées montrent que les miARN paralogues miR-103 et miR-107 sont régulés positivement par le stress oxydatif44 et répriment la traduction de LRP1 dans plusieurs lignées cellulaires45. Nous avons donc émis l'hypothèse que miR-103 et miR-107 sont impliqués dans la régulation négative de LRP1 induite par l'amyline dans les CE microvasculaires. Les CE incubées avec 10 µM d'amyline humaine formant de l'amyloïde pendant 24 h ont montré une augmentation des niveaux de miR-103 et de miR-107, comme l'indiquent les données de RT-PCR des lysats de CE (Fig. 6h). En utilisant les mêmes lysats capillaires de rat HIP et WT que ci-dessus (Fig. 6g), nous avons détecté des niveaux plus élevés de miR-103 et de miR-107 dans les capillaires de rat HIP par rapport à WT (Fig. 6i), conformément aux résultats in vitro (Fig. 6i). .6h). TargetScan prédit que miR-103 et miR-107 se lient directement à LRP1 (Fig. 6j). Par conséquent, nous avons co-transfecté des imitateurs miR-103 et miR-107 dans des CE microvasculaires, puis avons utilisé l'antagomir (amiR)-103 et amiR-107 pour faire taire la régulation à la hausse induite par l'amyline de miR-103 et miR-107. Nos résultats montrent que miR-103/107 régule à la baisse LRP1 (Fig. 6k), reproduisant l'effet de l'incubation avec de l'amyline humaine formant de l'amyloïde (Fig. 5h). AmiR-103/107 sauve l'expression de LRP1 dans les CE suite à un stress cellulaire induit par l'amyline (co-incubation avec 10 μM d'amyline humaine) (Fig. 6l); cependant, amiR-103/107 ne sauve pas l'expression de la P-gp (Fig. 6m).

Pris ensemble, nos résultats (Figs. 2–6) suggèrent un lien potentiel entre l'amyline pancréatique chroniquement dérégulée et l'efflux d'Aβ de rat altéré du cerveau dans la circulation systémique par des mécanismes qui impliquent : 1, une vasculopathie à l'amyline entraînant une vasodilatation cérébrale réduite et une altération drainage liquide le long des parois des vaisseaux sanguins cérébraux; et 2, un dysfonctionnement endothélial induit par l'amyline entraînant une régulation négative de la P-gp et de la LRP1 au niveau de la BHE. Chez les rats HIP, des causes autres qu'une diminution du transport, telles que des taux de dégradation modifiés de l'Aβ, une agrégation accrue provoquant une dissimulation immunologique de l'Aβ, un afflux accru d'Aβ ou une augmentation des taux sanguins d'Aβ pourraient expliquer la diminution du rapport plasma-cerveau pour l'Aβ .

Des études antérieures utilisant un test d'expression génique TaqMan ont révélé que les gènes de la microglie pro-inflammatoires et anti-inflammatoires étaient exprimés de manière différentielle (DE) dans les groupes de rats HIP et WT25. Pour prédire d'éventuels modèles moléculaires amples dans les gènes cérébraux associés à une exposition chronique à l'amyline humaine formant de l'amyloïde pancréatique dans le sang, nous avons utilisé des analyses d'ARN-seq et du réseau d'expression génique des gènes hippocampiques chez les rats mâles HIP vs WT (âge, 15-16 -mois). La comparaison des données RNAseq des rats HIP et WT (n = 10 mâles/groupe) a permis l'identification de 408 transcrits de gènes exprimés de manière différentielle (P < 0,05). La plage d'amplitude caractéristique du changement des gènes DE régulés à la hausse et à la baisse est illustrée à la figure 7a. Les gènes DE ont été annotés dans la base de données Ingenuity Pathway Analysis (IPA), qui a identifié l'enrichissement de plusieurs voies canoniques représentées par ces gènes (Fig. 7b). Parmi les gènes DE chez les rats HIP par rapport aux rats WT, 25 gènes ont identifié l'enrichissement des 5 principales voies canoniques, comme le montre la carte thermique de regroupement hiérarchique de ces gènes DE (Fig. 7c). Nous avons en outre classé les 408 gènes DE sur la base de l'ontologie des gènes (GO) en utilisant la base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée (DAVID) en processus biologiques enrichis en HIP par rapport aux rats WT (Fig. 7d). Ces résultats (Fig. 7b – d) suggèrent que la dérégulation des gènes impliqués dans les réponses cellulaires à l'inflammation, le métabolisme altéré et l'hypoxie peuvent être associés à une augmentation chronique des concentrations sanguines d'amyline, au dépôt cérébrovasculaire d'amyline et à une altération de la clairance cérébrale Aβ.

a Le Log10 (valeur de p) par rapport à Log10 (changement de facteur) des gènes DE dans les cerveaux de rats HIP vs WT. Chaque point représente un gène, avec une régulation positive en couleur rouge (HIP vs WT, changement ≥ 1,5 fois), une régulation négative en couleur bleue (HIP vs WT, changement ≥ 1,5 fois) et < 1,5 fois changement en couleur noire . b Top 5 des voies canoniques identifiées par Ingenuity Pathways Analysis des gènes différentiellement exprimés (DE) détectés par analyse ARN-seq du tissu hippocampique des groupes de rats HIP vs WT (P < 0,05) (n = 10 mâles/groupe). c Le regroupement hiérarchique de 25 gènes DE a identifié l'enrichissement des 5 principales voies canoniques en (b). d Top 5 des processus biologiques Gene Ontology (GO) enrichis dans le groupe de rats HIP par rapport au groupe de rats WT.

Nos données provenant de modèles humains et animaux de laboratoire montrent qu'un mécanisme potentiellement critique permettant à la pathologie Aβ cérébrale de se développer implique l'accumulation cérébrovasculaire d'amyline formant de l'amyloïde sécrétée par le pancréas. Parce que l'amyline pancréatique contribue au développement du DM de type 2, nos résultats suggèrent une interaction amyline-Aβ comme un lien moléculaire manquant potentiel entre le DM de type 2 et la MA, et une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Nous avons trouvé trois facteurs interdépendants qui semblent sous-tendre l'altération induite par l'amyline de la clairance cérébrale de l'Aβ : 1, les concentrations d'amyline dans le sang sont augmentées dans la démence par rapport aux individus sans troubles cognitifs ; 2, des concentrations chroniquement accrues d'amyline formant de l'amyloïde dans le sang favorisent l'accumulation d'amyline dans les monocytes circulants reflétant une inflammation systémique et conduisant à un dépôt d'amyline cérébrovasculaire; et 3, le dépôt d'amyline cérébrovasculaire perturbe le transport Aβ médié par LRP1-Pgp à travers la BBB et la clairance Aβ par le drainage du liquide interstitiel le long des parois vasculaires, comme indiqué par la co-localisation de l'amyline-Aβ dans les parois des vaisseaux sanguins et les espaces périvasculaires.

La sécrétion compensatoire d'insuline est au cœur de la résistance à l'insuline et coïncide avec une augmentation de la sécrétion d'amyline8,9,10 (également démontrée par nos données actuelles chez les participants d'une cohorte couvrant le continuum cognitif allant de la déficience cognitive à la déficience cognitive légère et à la démence ; Fig. 1d). Étant donné que les patients atteints de diabète de type 2 sont résistants à l'insuline pendant de nombreuses années avant leur diagnostic clinique, ils sont exposés à une hyperamylinémie chronique liée au dépôt pancréatique d'amyline amyloïde8,9,10, à l'activation de l'inflammasome NLRP3 et à une sécrétion accrue d'IL-pro-inflammatoire. 1β des macrophages et des cellules dendritiques11,12,13. Nos données montrant l'amyline engloutie par les monocytes circulants en association avec des concentrations plasmatiques accrues d'IL-1β indiquent des réponses immunitaires innées possibles à des concentrations accrues d'amyline formant de l'amyloïde pancréatique dans le sang. Ces données suggèrent que le dépôt d'amyline cérébrovasculaire conduisant à une inflammation périvasculaire peut se développer, au moins en partie, en raison d'une réaction immunitaire innée inadéquate aux concentrations croissantes d'amyloïde pancréatique liées au prédiabète dans le sang. Des études futures devraient déterminer si la modulation de la voie amyline-IL-1β pourrait fournir une approche pour contrer la neuroinflammation dans le cadre de la MA.

Les dépôts périvasculaires d'Aβ sont fréquents dans les cerveaux atteints de MA et ont été attribués à un mauvais drainage du liquide interstitiel2,3,4. La force motrice du drainage du liquide interstitiel provient de la contraction et de la relaxation spontanées des cellules musculaires lisses vasculaires2,3,4. Nos résultats montrent des associations entre l'inflammation systémique médiée par l'amyline et la vasodilatation cérébrale réduite et le CBF par dérégulation de l'arginase-NO dans la paroi vasculaire. Nos données montrent également que l'amyline formant l'amyloïde pancréatique s'accumule dans les capillaires cérébraux et peut affecter l'expression de la P-gp et de la LRP1, des protéines qui assurent le transport de l'Aβ à travers la BHE. Bien que les voies régulées par APOE/LRP1 aient un rôle bien établi dans la clairance cérébrale de l'Aβ46, la possibilité que l'expression de LRP1 puisse être régulée à la baisse par l'amyline du côté luminal du vaisseau sanguin peut représenter une nouvelle cible thérapeutique pour réduire la pathologie de la MA.

En conclusion, nos données suggèrent que le dépistage du dérèglement de l'amyline pancréatique en mesurant l'accumulation d'amyline dans le sang et les monocytes circulants pourrait identifier les personnes à risque accru de pathologies microvasculaires cérébrales et de MA. Ceci est également important car les troubles de la fonction exécutive et de la mémoire de travail sont fréquents chez les personnes atteintes de diabète de type 2 sans démence1, et la dérégulation de l'amyline est associée au diabète de type 2 et peut être un facteur contributif possible à ces effets cliniques. Le diabète de type 2 et la maladie d'Alzheimer, deux menaces croissantes pour la santé mondiale, semblent liés par des mécanismes complexes14,47,48,49,50 impliquant éventuellement l'amyline formant de l'amyloïde en tant que facteur moléculaire au-delà de la dérégulation du glucose et de l'insuline. L'inflammation cérébrovasculaire médiée par l'amyline, l'altération de la clairance cérébrale de l'Aβ et l'expression génique dérégulée dans le cerveau apparaissent comme des caractéristiques biologiques de l'hypersécrétion pancréatique d'amyline (prédiabète). Les présentes données peuvent améliorer la compréhension des mécanismes de l'inflammation cérébrovasculaire et du risque d'élimination altérée de l'Aβ du cerveau dans le cadre d'une résistance à l'insuline prédiabétique, lorsque la concentration d'amyline sanguine est chroniquement élevée. L'inhibition de l'inflammation systémique et cérébrovasculaire causée par l'amyline formant de l'amyloïde pancréatique pourrait réduire la dérégulation cérébrovasculaire de l'arginase-NO, la vasoconstriction, les réductions du flux sanguin et l'accumulation cérébrale d'Aβ.

Cette recherche a utilisé du sang total, du plasma et des tissus cérébraux congelés et fixés au formol anonymisés de la biobanque du Centre de recherche sur la maladie d'Alzheimer de l'Université du Kentucky (UK-ADRC) dans le cadre d'un protocole approuvé par le Conseil d'examen institutionnel de l'Université du Kentucky ( IRB). Le consentement éclairé a été obtenu prospectivement. Des échantillons de sang total ont été prélevés sur 83 participants d'une cohorte couvrant le continuum cognitif allant de la déficience cognitive à la déficience cognitive légère et à la démence et 80 échantillons ont été analysés (tous inclus dans le même kit ELISA à l'amyline). Les mesures ont été effectuées en double. Des échantillons de tissu de cortex temporal congelés ont été obtenus de 42 personnes atteintes de démence de type sAD documentée par la positivité de l'amyloïde β (Aβ) et de 18 personnes sans troubles cognitifs. Du plasma et du tissu cérébral congelé ont été obtenus à partir de 20 individus. Le cortex frontal dorsolatéral fixé au formol (zone Brodmann 9) a été obtenu à partir de 32 individus. Des statistiques récapitulatives pour les individus fournissant chaque type de tissu, y compris la taille de l'échantillon, l'état cognitif, le sexe, l'état du diabète et l'âge, ainsi que des informations cliniques et neuropathologiques, sont présentées dans les tableaux 1,2. L'absence/présence de diabète a été déterminée au cours de la vie (lors de visites cliniques longitudinales) par l'auto-déclaration du patient ou de l'aidant et l'utilisation de médicaments contre le diabète. L'évaluation de la démence clinique et des caractéristiques neuropathologiques, y compris les plaques amyloïdes neuritiques, le Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD), le stade Braak NFT et la gravité de l'angiopathie amyloïde cérébrale (CAA), a été notée selon les protocoles publiés27,28,29 ,30,31. Une analyse IHC secondaire du dépôt d'amyline-Aβ cérébrovasculaire a été réalisée dans un sous-ensemble de cerveaux fAD (n = 27) avec une accumulation d'amyline documentée par IHC et ELISA21. Des tissus de cortex temporal fixés au formol provenant de porteurs de la mutation fAD ont été fournis par la Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders de l'UCL Queen Square Institute of Neurology (Royaume-Uni) et le King's College de Londres (Royaume-Uni).

Des analyses en aveugle par l'observateur ont été effectuées sur tous les échantillons de tissus humains ; les résultats ont été communiqués au centre AD de l'université du Kentucky pour évaluer les relations avec la pathologie de la maladie d'Alzheimer/la fonction cognitive. Les enquêteurs ont également été aveuglés dans la notation des analyses histologiques et dans les tests longitudinaux du comportement animal pour éviter les biais. Les investigateurs n'étaient pas en aveugle pendant l'intervention/l'injection pharmacologique car les interventions étaient effectuées par le même personnel. Les enquêteurs n'ont pas été mis en aveugle pendant la plupart des essais biochimiques car cela n'est pas nécessaire. La collecte des données a été effectuée en même temps pour les groupes expérimentaux avec le même cadre.

Cette enquête est conforme au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par l'US National Academies Press (8e édition, 2011) et a été approuvé par l'Institutional Animal Care and Use Committee de l'Université du Kentucky. Les rats ont été logés dans des cages ventilées individuellement, sur un cycle de lumière de 12 h, et ont reçu une alimentation standard en granulés et de l'eau ad libitum.

Nous avons comparé des rats qui développent un diabète de type 2 lié à l'expression d'amyline humaine formant de l'amyloïde dans le pancréas (rats mâles HIP ; n = 84) avec des rats de type sauvage témoins qui expriment de l'amyline de rat endogène non amyloïdogène dans le pancréas (rats WT ; n = 52). Les couples reproducteurs ont été achetés au Charles River Laboratory. Pour les analyses transversales de l'amyline sanguine et du glucose, nous avons utilisé des rats HIP âgés de 6 à 8 mois, de 10 à 12 mois et de 15 à 16 mois. Pour toutes les autres expériences, nous avons utilisé des rats âgés de 15 à 16 mois. Nous avons en outre utilisé des rats APP / PS1 / HIP (n = 10 mâles; âgés de 15 à 16 mois) pour étudier l'impact de l'amyline humaine formant de l'amyloïde pancréatique sur l'Aβ cérébrovasculaire dans le cadre d'une pathologie de type MA. Des rats APP/PS1/HIP ont été générés comme décrit précédemment21. En bref, des rats TgF344-19 du Rat Resource and Research Center, Univ. du Missouri, Columbia, MO (rats APP/PS1) sont des rats Fischer qui expriment le gène de la protéine précurseur humaine Aβ (A4) (hAPP) avec la mutation suédoise (K595N/M596L) et le gène de la préséniline 1 (PSEN1) avec une délétion de l'exon 9, piloté par le promoteur du prion de souris (Prp). Les rats APP/PS1 ont été croisés avec des rats HIP pour générer des rats triplement transgéniques pour l'amyline humaine, APP et PSEN1 (rats APP/PS1/HIP). Des rats APP/PS1 (n = 10 mâles ; âgés de 15 à 16 mois) qui expriment de l'amyline de rat non amyloïdogène ont servi de témoins pour les effets de l'amyline humaine amyloïdogène. Nous avons également utilisé des tissus pancréatiques et cérébraux de rats knock-out pour l'amyline (AKO) 21 (n = 3 mâles; âgés de 15 à 16 mois) comme témoins négatifs pour l'expression de l'amyline. Un total de n = 159 rats mâles a été utilisé dans l'étude.

Des IRM ont été réalisées sur des compagnons de portée HIP et WT à l'aide d'un scanner IRM nucléaire horizontal 7 T (ClinScan, Brucker BioSpin MRI, Ettlingen, Allemagne)18. Les images coronales pondérées en T2 ont été obtenues à l'aide de paramètres génériques : champ de vision (FOV) 40 mm, temps de répétition (TR) 3 000 ms, temps d'écho (TE) 24 ms, épaisseur de coupe 1 mm, écart entre les coupes 1 mm, 7 coupes . La perfusion cérébrale a été évaluée à l'aide du protocole ASL publié35. Les images anatomiques et de perfusion ont été co-enregistrées et filtrées avec les routines de la boîte à outils ASL. Un masque a été défini manuellement pour chaque rat afin d'exclure les deux tissus de l'extérieur du cerveau car le seuillage était parfois insuffisant pour exclure ces tissus. Il a également été déterminé que les pixels situés à la périphérie du cerveau introduisaient de grandes variations dans les valeurs de perfusion, probablement en raison d'effets partiels de volume et de susceptibilité, et étaient donc également exclus. Les valeurs de perfusion ont été déterminées sans savoir à quels groupes appartenaient les rats pour éviter les biais.

Les déficits des membres antérieurs du rat ont été évalués par le temps de contact entre les membres antérieurs et la paroi dans le test du cylindre. La capacité d'équilibre du rat a été déterminée en enregistrant l'angle auquel l'animal a commencé à glisser sur un plan incliné ascendant. Les anomalies des membres postérieurs du rat ont été évaluées en notant la sévérité de l'étreinte des membres postérieurs. Pour le test rotarod, les animaux ont été acclimatés à la tige statique 2 jours avant le test. Le jour du test, la vitesse du rotarod a été augmentée de 0 à 40 tr/min en 2 min. Chaque rat a été testé sur le Rotarod pour un total de 4 essais par jour pendant 5 jours consécutifs. Pour chaque jour d'entraînement, la plus petite valeur de latence à la chute pour chaque rat a été écartée. Les lectures restantes ont été moyennées et une moyenne de groupe a été calculée pour les groupes HIP et WT. La méthode du score z composite a été utilisée pour les analyses21. Pour chaque test de comportement, la moyenne et l'écart type ont été calculés à partir de variables individuelles recueillies à partir d'évaluations longitudinales d'animaux dans les groupes expérimentaux. Le score Z pour chaque animal dans chaque test de comportement a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

Le score composite pour chaque animal a été calculé en faisant la moyenne des scores z de chaque test.

Pour l'immunohistochimie, des tissus cérébraux d'humains et de rats fixés au formol et inclus en paraffine ont été traités à l'aide de protocoles publiés15,18,21,25,26,34. En bref, les coupes de tissus ont été déparaffinées dans du xylène 3 fois pendant 5 min. Les coupes ont été réhydratées deux fois dans des dilutions en série (100 %, 95 et 70 %) d'alcool et lavées une fois dans du PBS. Les coupes ont été incubées dans 3 % de H2O2 (dilué dans du méthanol) pendant 30 min à température ambiante pour bloquer la peroxydase endogène interne. Les sections ont ensuite été incubées dans un tampon de récupération 1 × (S1699; Dako) pendant 30 min à 95 ° C dans un vaporisateur pour la récupération de l'antigène. Les coupes ont été refroidies à température ambiante et lavées une fois dans du PBS 1X. Les coupes ont été bloquées pendant 1 h dans une solution de sérum de cheval à 15 % et lavées une fois dans du PBS. Les coupes ont été incubées avec un anticorps anti-amyline pendant 24 h. Le deuxième jour, toutes les sections ont été lavées 2 fois dans du TBS 1X. Toutes les sections ont été incubées avec un anticorps secondaire IgG biotinylé pendant 1 h. Toutes les coupes ont été à nouveau lavées et incubées avec le complexe ABC pendant 30 min. Toutes les coupes ont été lavées et développées dans du chromogène AEC. Les sections ont été lavées et bloquées dans du NGS à 10 % pendant 1 h. Les coupes ont été incubées avec le deuxième anticorps primaire pendant une nuit. Le troisième jour, toutes les sections ont été lavées et incubées avec un anticorps secondaire conjugué à l'AP pendant 1 h. Toutes les coupes ont été lavées et développées dans du chromogène Stay-green. Toutes les sections ont été lavées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et montées dans un milieu de montage à base d'eau. Anticorps contre l'amyline (1:200; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), GFAP (1:400; 3670S, Cell Signaling Technology), CD68 (1:200; MCA341GA, Biorad,), CD11b (1:200; MCA275GA , Biorad,) et Aβ (1:400; clone 6E10, 803002, Biolegend) étaient les anticorps primaires. L'IgG conjuguée anti-souris-AP de cheval IMPRESS biotinylée (1:100, A3562, Sigma) et l'IgG anti-lapin biotinylée (1:300, BA-1100, Vector) étaient les anticorps secondaires. La spécificité de l'anticorps anti-amyline dans les tissus cérébraux humains et de rat a été établie dans des études antérieures15,18,21,25,26,34. Le tissu pancréatique de rats AKO était le témoin négatif pour l'amyline.

Dans les expériences d'immunofluorescence, nous avons utilisé des tissus cérébraux humains fixés au formol et inclus en paraffine, traités à l'aide de protocoles publiés18,21. En bref, les coupes de tissus ont été déparaffinées dans du xylène (trois fois, 10 min chacune), réhydratées dans une dilution en série d'alcool (100%, 95%, 85%) et lavées une fois dans du PBS 1 ×. La récupération de l'antigène a été effectuée dans un tampon citrate (1 ×, S1699; Dako) (chauffé pendant 30 min à 90 ° C). Les sections ont été bloquées dans un tampon de blocage (5% NGS, 2% BSA et 0,25% Triton-X dans 1 × TBS) pendant 1 h à température ambiante. Après blocage, les sections ont été incubées dans un mélange d'anticorps primaires pendant 24 h à 4 ° C. Les coupes ont été lavées dans une solution de tris-NaCl 1X (trois fois, 5 min chacune). Les coupes ont été incubées dans un mélange d'anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante. Les coupes ont été lavées dans du tri-NaCl comme précédemment et incubées dans du noir de Soudan à 0,2 % pendant 5 minutes pour bloquer l'auto-immunofluorescence. Les sections ont été lavées trois fois dans du PBS 1 × et montées dans un milieu de montage. Les sections ont été imagées après 24 h de montage. Anti-amyline (1:200 ; clone E5 ; SC-377530 ; Santa Cruz et 1:200 ; et T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), Aβ (1:400 ; clone 6E10, 803002, Biolegend), IL- 1β (1:400 ; ab9722, Abcam), anti-collagène IV (1:500 ; ab6586 ; abcam), anti-actine musculaire lisse alpha-Alexa Fluor 405 (1:200 ; ab210128, abcam), anti-cavéoline-1 (1:100; sc-894; Santa Cruz, TX), anti-LRP1 (1:500; sc-57351; Santa Cruz), anti-4HNE (1:200; ab46545; abcam) étaient les anticorps primaires. Les anticorps secondaires étaient : Alexa Fluor 488 IgG anti-lapin (A11034 ; Thermo Fisher), Alexa Fluor 488 IgG anti-souris conjugué (1:300 ; A11029 ; Invitrogen), Alexa Fluor 568 IgG anti-lapin conjugué (1:200 ; A11036 ; Invitrogen) et Alexa Fluor 568 IgG anti-souris conjugué (1:300 ; A11004 ; Invitrogen). Les noyaux ont été contre-colorés avec un support de montage DAPI. Pour la triple coloration des tissus cérébraux humains, un anticorps d'actine musculaire lisse-Alexa Fluor 405 a été ajouté après la coloration de l'amyline humaine et du collagène IV et un milieu de montage sans DAPI a été utilisé. Pour la coloration à la thioflavine S, après une incubation secondaire des anticorps, les lames de cerveau ont été incubées dans de la thioflavine S à 0, 5% pendant 30 minutes à température ambiante. Les lames ont ensuite été incubées pendant 3 min dans de l'éthanol à 70 %, 5 min dans du noir de Soudan à 0,2 % avant lavage et montage.

Pour les analyses IHC, les signaux d'intensité d'immunoréactivité pour chaque anticorps (amyline, Aβ) ont été déconvolués et analysés à l'aide du plugin Color Deconvolution dans ImageJ. La détermination du vecteur (profil RVB) et le seuil ont été établis pour chaque couleur d'intérêt à l'aide d'images de la tache unique (c'est-à-dire le contrôle positif pour chaque anticorps testé). Le seuil de chaque image a été défini pour minimiser visuellement l'arrière-plan. Le profil et le seuil RVB établis ont été appliqués à une commande de script de macro. La commande macroscript a été appliquée aux groupes expérimentaux et le pourcentage de surface positive pour la couleur d'intérêt a été mesuré. Pour le dépôt d'amyline-Aβ cérébrovasculaire estimé, les vaisseaux sanguins clairement définis qui étaient positifs pour l'amyline, l'Aβ ou les deux ont été comptés. Le nombre de vaisseaux sanguins a été normalisé par rapport à la zone d'imagerie totale.

Des capillaires cérébraux fraîchement isolés ont été colorés pour le STORM à l'aide d'anticorps primaires (anti-amyline humaine ; T-4157 ; laboratoires Peninsula et anti-glycophorine A ; sc-71159 Santa Cruz biotech) et d'anticorps secondaires (lapin IgG-atto 647 et souris IgG- atto 488) comme suit : des boîtes à fond de verre de 35 mm (P35G-0.170-14-C, MatTek Corporation) ont été nettoyées avec 1 M de KOH pendant 15 min sur sonicateur, rincées avec de l'eau Milli-Q et stérilisées au moins 30 min sous lumière UV . Des capillaires cérébraux fraîchement isolés ont été étalés sur les boîtes ci-dessus pendant 30 min à température ambiante et lavés avec 500 µl de PBS 1X. Les capillaires ont été fixés avec 200 µl de 3 % PFA + 0,1 % de glutaraldéhyde pendant 10 min à température ambiante et réduits avec 200 µl de 0,1 % NaBH4 pendant 7 min à température ambiante. Les capillaires ont été lavés trois fois avec du PBS et bloqués avec 200 µl de tampon de blocage (3 % BSA + 0,2 % Triton X-100 dans du PBS) pendant 120 min à température ambiante sur la bascule. Ensuite, 200 µl de cocktail d'anticorps primaires ont été ajoutés pendant 60 min à température ambiante sur la bascule et lavés cinq fois avec 200 µl de tampon de lavage (0,2 % BSA + 0,05 % Triton X-100 dans du PBS) pendant 15 min par lavage à température ambiante. sur la bascule. Après lavage, 150 µl de cocktail d'anticorps secondaires ont été ajoutés pendant 30 min à température ambiante et lavés trois fois avec 200 µl de tampon de lavage pendant 10 min à chaque lavage sur la bascule. Les capillaires ont été postfixés avec 200 µl de 3%PFA + 0,1% de glutaraldéhyde pendant 10 min à température ambiante et stockés dans 500 µl de PBS et conservés dans un tampon d'imagerie STORM [7 µl de GLOX (capteur d'oxygène) et 70 µl de MEA (chlorhydrate de cystéamine) + 620 µl de tampon B (Tris-HCL/NaCl)] lors de l'imagerie à l'aide d'un microscope Nikon N-SIM N-STORM (Nikon).

Des coupes de cerveau fixées au formol et incluses en paraffine (10 μm) ont été réhydratées et prétraitées avec de l'acide formique à 95% pendant 3 min à température ambiante pour exposer les antigènes. Après rinçage dans un tampon Tris-HCl à 50 mmol/L avec du NaCl à 150 mmol/L (pH 7,4), des coupes de cerveau ont été incubées avec des anticorps primaires anti-amyline humaine (anti-amyline humaine ; T-4157 ; Laboratoires Peninsula) et des anti-souris de souris. -Anticorps Aβ 6E10 (803002, Biolegend) pendant une nuit à 4 °C. Duolink in situ PLA (Duolink In situ PLA, DUO92004, Sigma, USA) a été réalisé selon le protocole publié26. En bref, pour la détection des paires d'anticorps primaires, les coupes ont été incubées pendant 90 min avec des IgG anti-souris MINUS conjuguées à des oligonucléotides et des IgG anti-lapin PLUS (sondes PLA) diluées au 1: 6 dans une solution saline tamponnée au Tris à 37 ° C. Des brins d'ADN amplifiés ont été détectés avec des oligonucléotides conjugués à un fluorophore et des noyaux colorés avec un colorant Hoechst.

Chaque échantillon de sang (100 µl) a été incubé avec un mélange d'anticorps primaires CD14 (Abcam, ab203294, 1:400) et d'amyline humaine (Santa Cruz, SC-377530, 1:100) pendant 30 min à température ambiante. Le sang a été lysé dans 2 ml de tampon de lyse (solution de lyse 1 × BD, Cat # 349202, BD Biosciences) pendant 5 min et a été lavé dans 1 × PBS avec 4% de sérum de veau fœtal (FCS). Les cellules restantes après lavage ont été incubées dans des anticorps secondaires pendant 30 min à température ambiante, puis ont été lavées et remises en suspension dans 0,5 ml de 1 x PBS avec 4 % de FCS. Les anticorps secondaires étaient Alexa Fluor 488 chèvre anti IgG de souris (H + L) (cat # A11029; Invitrogen, dilution 1: 200 dans 1 × PBS avec 4% de FBS) pour l'amyline humaine, et Alexa Fluor 568 chèvre anti souris (cat # A11004 , Invitrogen, dilution 1:200, dans 1xPBS avec 4% FBS), pour CD14, respectivement. L'analyse de flux a été effectuée sur des cytomètres BD Symphony A3. Les cellules restantes ont été contrôlées sur SSC-A contre FSC-A pour déterminer les populations de cellules vivantes. Les doublets (cellules agrégées) ont été éliminés en utilisant FSC-H contre FSC-A. Les cellules non agrégées ont ensuite été fermées pour sélectionner les monocytes qui étaient positifs pour CD14 et/ou l'amyline humaine. Un contrôle négatif (pas d'anticorps) et un contrôle positif (monocytes humains) ont été utilisés pour définir les limites supérieure et inférieure (Fig. S4 supplémentaire).

Les données ont été acquises à l'aide de BDFacsDiva et analysées à l'aide du logiciel FlowJo v10.

Des tissus cérébraux humains congelés ont été homogénéisés dans un tampon d'homogénat (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, NaF 50 mM, 2 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 1 % (v/v) inhibiteurs de protéase et de phosphatase, pH 7,5) . Les homogénats ont été centrifugés à 17 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Le surnageant a été séparé du culot après centrifugation et a ensuite été utilisé pour toutes les expériences. Des échantillons de cerveau de rat congelés ont été homogénéisés avec du tampon Triton à 1 % (25 fois le volume de tissu) contenant du Tris-HCl 20 mM, du NaCl 150 mM, de l'EDTA 1 mM, de l'EGTA 1 mM, du Triton X-100 à 1 % (v/v), du (v/v) inhibiteurs de protéase et de phosphatase, pH 7,5. Les homogénats ont été laissés sur glace pendant 15 min. Les homogénats ont été centrifugés à 22 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Le surnageant (fraction soluble dans le Triton) a été séparé du culot et utilisé pour toutes les expériences.

Amylin ELISA (EZHA-52K, Millipore Sigma) a été utilisé pour mesurer les concentrations d'amyline dans les lysats de sang total, le plasma, les lysats capillaires et les homogénats de cerveau. La concentration d'insuline a été mesurée dans les lysats de sang total à l'aide d'un kit ELISA sandwich (AYQ-E10465, Assay Solution). Les concentrations d'Aß42 dans les homogénats de cerveau ont été mesurées à l'aide du kit ELISA sandwich pour Aß42 (Thermo Fisher Scientific, cat # KHB3441). Des ELISA pour IL-1β (ab255730, abcam), arginase 1 (MBS289817, MyBioSource) et arginase 2 (MBS7216305, MyBioSource) ont été utilisés selon les protocoles du fabricant. Les concentrations de protéines cibles ont été normalisées à la quantité d'apport total de protéines évaluée à l'aide de la méthode BCA.

L'activité de l'arginase a été mesurée dans les lysats de microvaisseaux cérébraux à l'aide d'un test colorimétrique (MAK112, Sigma, MO, USA). Le dosage a été réalisé selon le protocole publié34. En bref, les échantillons ont été incubés avec 10 µl de tampon de substrat 5x pendant 2 h à 37 °C. Aucun substrat n'a été ajouté aux puits de blanc d'échantillon. Pour arrêter la réaction de l'arginase, 200 ul du réactif d'urée ont été ajoutés à chaque puits (étalon d'urée, eau, échantillons et blanc d'échantillon). Ensuite, 10 µl de tampon de substrat 5x ont été ajoutés aux puits de blanc d'échantillon et incubés à 37 ° C pendant 60 min. La lecture de l'absorbance a été prise à 430 nm. L'activité de l'arginase a été calculée sur la base des instructions d'analyse du fabricant.

Le dosage des nitrites (M36051, Molecular probes) et le dosage des nitrates (ab65328, Abcam) des échantillons de plasma de rat ont été effectués selon le protocole du fabricant. En bref, pour le dosage des nitrites, les 100 premiers µl de réactif de quantification des nitrites de travail ont été chargés sur une microplaque, puis 10 µl de standard de nitrite et d'échantillons de plasma ont été ajoutés en double. La microplaque a été incubée pendant 10 min à température ambiante, puis 5 µl de révélateur de quantification de nitrite ont été ajoutés à chaque puits. Après le développement optimal de la couleur, les intensités de fluorescence ont été mesurées à 365/450 nm (excitation/émission). Pour le dosage des nitrates, les premiers 85 µl d'étalons de nitrate et 85 ul d'échantillons de plasma ont été chargés sur une microplaque en double, puis 5 µl de nitrate réductase et 5 µl de cofacteur enzymatique ont été ajoutés à chaque étalon et puits d'échantillon. La plaque a été incubée pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, 5 µl d'activateur ont été ajoutés à chaque étalon et échantillons bien suivis de 50 µl de réactif de Griess R1 et R2. Les intensités de sortie ont été mesurées sur un lecteur de microplaques à 540 nm.

Des capillaires cérébraux ont été isolés de cerveaux de rats en utilisant le protocole publié18. Les cerveaux ont été homogénéisés dans du PBS glacé et mélangés avec une solution de Ficoll à 30% en inversant doucement les tubes, puis centrifugés à 5800 × g pendant 20 min à 4 ° C. Les culots ont été remis en suspension dans du PBS glacé avec 1 % de BSA et ont été passés à travers la colonne de billes de verre. Les billes ont été agitées dans du PBS avec du PBS à 1 % à l'aide d'une pipette de 25 ml et les solutions ont été réparties également dans deux tubes de 50 ml. Les tubes ont été centrifugés et les culots ont été dissous dans 0,5 à 1 ml de PBS et utilisés pour des expériences.

Les artères cérébrales médianes ont été retirées, nettoyées du tissu conjonctif et placées dans un tampon de digestion contenant (en mmol/L) 130 NaCl, 1 KCl, 0,2 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 3 pyruvate, 25 HEPES et 22 glucose (ajusté au pH 7.4 avec NaOH). Les artères ont ensuite été incubées pendant 15 min à 37 °C dans un tampon de digestion additionné de papaïne (0,5 mg/mL) et de dithiothréitol (1 mg/mL) suivi d'une seconde incubation (15 min à 37 °C) dans un tampon de digestion additionné de Sigma collagénases de type F et de type H (1 mg/mL chacune). Les artères ont ensuite été lavées avec un tampon de digestion et conservées sur de la glace pendant 15 minutes, après quoi une agitation douce avec une pipette Pasteur polie au feu a été utilisée pour créer une suspension cellulaire.

Le tonus artériel a été mesuré dans les artères cérébrales piale et postérieure fraîchement isolées à l'aide d'un système IonOptix Vessel Diameter et d'un protocole publié36. En bref, des artères ont été isolées d'un cerveau de rat frais et disséquées sans tissus conjonctifs. Les branches ont été liées dans HEPES-PSS (NaCl 141,9 mM, KCL 4,7 mM, MgSO4 1,7 mM, EDTA 0,5 mM, CaCl2 2,8 mM, HEPES 10 mM, KH2PO4 1,2 mM et glucose 5 mM). Une extrémité de l'artère a été canulée sur une micropipette dans la chambre expérimentale du myographe et l'autre extrémité a été fermée en aveugle. L'absence de fuite a été vérifiée par le maintien d'une pression stable. Initialement, la pression intraluminale a été maintenue à 10 mmHg pendant 15 min, puis la pression intraluminale a été augmentée de 20 à 60 mmHg (20 mmHg→40 mmHg→ 60 mmHg→80 mmHg-→100 mmHg-→120 mmHg) stimulant le développement du tonus artériel. Le diamètre stable après chaque augmentation de la pression intravasculaire a été enregistré comme diamètre actif. Ensuite, HEPES-PSS a été remplacé par un EGTA 0 calcium et 2 mM pour déterminer le diamètre artériel passif. La pression intraluminale a été réduite dans la direction opposée et le diamètre passif maximal a été enregistré pour chaque point de pression. Le tonus artériel a été calculé à l'aide de la formule suivante : tonus artériel = ((diamètre passif-diamètre actif)/diamètre passif) *100).

Pour immunoprécipiter Aβ à partir d'homogénats de cerveau et de plasma, un protocole publié a été utilisé21. En bref, 1 mg de protéine a été incubé avec Aβ anti-rat (2 µg; CST2454; Cell Signaling Technology) pendant une nuit avec une rotation de bout en bout, à 4 ° C. Le complexe antigène-anticorps a été ajouté à la bouillie de résine de protéine A/G immobilisée pendant 2 h à température ambiante, lavé et les échantillons élués des résines à l'aide d'un tampon d'élution. L'éluat a été utilisé pour l'analyse Western blot. Amersham ECL Rabbit IgG, Ab entier lié à HRP (provenant d'un âne) (Cytive, Cat # NA934V-HRP), contre les IgG à chaîne légère et lourde, était l'anticorps secondaire (dilution 1:20 000).

Une analyse Western blot a été effectuée sur des capillaires cérébraux isolés, un homogénat de tissu cérébral et du plasma de rats en utilisant des protocoles publiés15,18,21,25,26,34. Le tampon RIPA avec 2% de SDS a été utilisé pour récupérer les monomères Aβ à partir d'échantillons de cerveau congelés. Le lysat a été centrifugé à 17 000 × g pendant 30 min. Le surnageant a été séparé du culot après centrifugation puis utilisé pour le Western blot. Les niveaux de protéines totales ont été estimés à l'aide d'un kit BCA (23225, ThermoFisher). Anticorps anti-LRP1 reconnaissant la sous-unité β de LRP1 (1:1 000 ; clone 5A6 ; sc-57351 ; Santa Cruz), anti-glycoprotéine P ou Pgp (1:1000, ab170904, Abcam), polyclonal anti-amyline de lapin ( 1:2000; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories, CA), Aβ anti-rat et humain (1:1 000; 2454; Cell Signaling Technology), anti-β actine de souris (1:10 000; clone BA3R; MA5-15739 ; Thermo-Fisher), anti-GAPDH monoclonal de souris (1:10 000 ; clone 6C5 ; ab8245 ; Abcam), conjugué anti-IgG HRP de lapin (1:30 000 ; NA934VS ; GE Healthcare) et conjugué anti-IgG HRP de souris (1 : 20 000 ; NXA931 ; GE Healthcare) étaient des anticorps primaires. De l'Aß de rat immunoprécipité provenant d'homogénats de cerveau et du plasma correspondant (50 µg de protéine provenant d'un homogénat de tissu ou d'une élution d'Aß de rat immunoprécipité) ont été chargés sur des gels SDS-PAGE à 8 %. L'Aβ agrégé des homogénats de cerveau a été résolu en PAGE natif (non réducteur; non dénaturé). Les peptides Aβ monomères ont été résolus dans des gels Bis-Tris acides avec de l'urée 8 M. Pour améliorer le signal pour Aβ monomère, les membranes ont été bouillies pendant 3 min dans du PBS avant l'étape de blocage. La LRP1 dans les lysats capillaires cellulaires et cérébraux a été résolue à l'aide d'un gel Bis-Tris à 4–12% dans des conditions non réductrices. Les anticorps anti-lapin ou anti-souris conjugués à la HRP étaient des anticorps secondaires. Une charge égale dans les expériences de Western blot a été vérifiée en sondant à nouveau avec un anticorps monoclonal anti-β actine (élevé chez la souris, clone BA3R, Thermo Scientific; 1: 2000). Les taux de protéines ont été comparés par analyse densitométrique à l'aide du logiciel ImageJ. Des expériences de contrôle négatif ont été menées pour tester la spécificité des bandes identifiées dans le Western blot après immunoprécipitation (Fig. 5b). En bref, des échantillons d'homogénat de cerveau et de plasma en double (1 mg de protéine totale) ont été utilisés pour l'immunoprécipitation avec : 1, anticorps anti-Aß (CST2454 ; Cell Signaling Technology) ; et 2, anticorps anti-IgG (Cytive, Cat # NA934V-HRP). Après transfert et blocage, les deux membranes ont été incubées avec l'anticorps anti-Aß et analysées et imagées ensemble. Les résultats montrent des intensités de signal d'immunoréactivité nulles ou mineures dans l'ensemble d'échantillons immunoprécipités par IgG (Fig. S5 supplémentaire) démontrant la spécificité de l'anticorps Aβ.

Le peptide d'amyline humaine amidée lyophilisé (Anaspec #AS-60254-1) a été dissous dans du PBS pH 7,4 à la concentration de 50 uM. Le mélange a été incubé à 37 ° C pendant 72 h avec agitation occasionnelle pour permettre à l'amyline de former des agrégats. Une solution d'amyline humaine agrégée a été injectée à des rats AKO âgés de 9 à 10 mois via la veine caudale (60 µg/kg) (n = 3 rats mâles), quotidiennement via la veine caudale pendant 1 semaine.

Nous avons utilisé un modèle BBB in vitro avec dépôt d'amyline sur la monocouche EC et effets conséquents sur le transport Aβ à travers la monocouche EC. En bref, des cellules endothéliales microvasculaires primaires de cerveau de rat (Cell Applications Inc) ont été étalées sur des inserts Transwell-Clear à 24 puits avec une membrane en polycarbonate à pores de 0, 4 μm (Costar, Corning, NY, États-Unis) et des astrocytes primaires de cerveau de rat (Sigma) ont été cultivés à la puits du fond. L'intégrité de la barrière a été mesurée à partir de la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) à l'aide du compteur EVOM2 avec des électrodes STX-3 (World Precision Instruments). La TEER maximale a été atteinte en 8 à 10 jours de culture. Les perméabilités de la BBB à l'amyline humaine (10 μM; Anaspec; AS-60254-1), à l'amyline de rat (10 μM; American Peptide) et au DMSO (1 mM; véhicule) ont été évaluées à l'aide de FITC-Dextran 4 kDa (Fisher Scientific) dilué dans du Hank's Tampon de solution saline équilibrée (HBSS) avec 0,1 % de BSA (HBSS-BSA) comme marqueur de diffusion paracellulaire. Les coefficients de perméabilité ont été calculés à l'aide de la formule ; P = (ΔQ/Δt)/(A*C0), (ΔQ/Δt) = taux de changement FITC-Dextran ; A = surface de l'insert (0,33 cm2) ; C0 = Entrée initiale FITC-Dextran.

Dans les expériences de transcytose Aβ42, la monocouche EC a été incubée avec de l'amyline humaine (10 μM) ou un véhicule (DMSO) pendant 24 h. Après lavage, la chambre luminale a été remplacée par HBSS-BSA et la chambre abluminale par Aβ(1–42)-FAM (5 µM; Bachem) ou FITC-Dextran, respectivement. Des échantillons d'Aβ(1–42) ont été prélevés dans la chambre luminale pour la mesure des intensités de fluorescence Aβ(1–42) − FAM et FITC-Dextran et du quotient de transcytose (TQ) Aβ(1–42) comme décrit précédemment [38] : TQ = (Aβ(1–42) − FAM luminal /Aβ(1–42) − FAM input)/(FITC-Dextran luminal − FITC-Dextran input).

Le test de prolifération cellulaire CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS) (Promega) a été utilisé pour évaluer la cytotoxicité de l'amyline humaine formant de l'amyloïde sur la monocouche EC.

L'ARN total a été isolé à l'aide du kit d'isolement d'ARN total RNAqueous selon le protocole du fabricant (Invitrogen, AM1914). La synthèse et l'amplification de l'ADNc ont été effectuées à l'aide du kit iTaq Universal SYBR Green One-Step (Biorad; 1725151) avec les séquences d'amorces suivantes : LRP1 : avant (Fwd) 5ˊ-TTGTGCTGAGCCAAGACATC-3ˊ, inverse (Rev) 5ˊ-GGCGTGAAGACATGTAGGT-3ˊ ; et GAPDH : Fwd 5ˊ- GCTGCGTTTTACACCCTTTC-3ˊ, Rev 5ˊ-GTTTGCTCCAACCAACTGC-3ˊ (IDT, Inc, États-Unis). Pour la quantification des miARN, l'ADNc a été synthétisé à partir d'ARN total à l'aide du kit de synthèse d'ADNc de miARN avec poly (A) polymérase (ABMgood, G902). L'ADNc a été amplifié à l'aide de SYBR Green mastermix (Biorad) avec des amorces spécifiques aux miARN de (rno-miR-103-3p, MPR00332; rno-miR-107-3p, MPR00335; RNU6 house Keeping gene, MP-r99998) (ABMgood). Les données ont été analysées à l'aide de la méthode 2−ΔΔCt et les expériences ont été normalisées en GAPDH ou U6 miARN.

Pour étudier le rôle de la signalisation des miARN dans la suppression induite par l'amyline de l'expression endothéliale de LRP1, nous avons utilisé la transfection d'EC microvasculaires de cerveau de rat avec miR-103–3p (MCR01039), miR-107-3p (MCR01045) et contrôle (MCH00000) mimiques ( ABMbon). Antagomir miR-103-3p (IH-320345-05-0005), miR-107-3p (IH-320348-05-0005) et le contrôle négatif (IN-001005-01-05) (Dharmacon Inc.) ont été utilisés dans une tentative de sauvetage de l'expression de LRP1. Toutes les transfections ont été effectuées à l'aide de RNAiMAX (Invitrogen) selon le protocole recommandé par le fabricant. En bref, les CE ont été étalées à 50 % de confluence dans des plaques à six puits, suivies d'une co-transfection avec 100 nM de mimiques ou d'antagomirs 103-3p et 107-3p avec leurs témoins négatifs respectifs. Après 12 h, les groupes de cellules traitées à l'antagomir ont été encore traités avec 10 μM d'amyline humaine pendant 24 h. Après 36 h de transfection, les cellules ont été récoltées pour une analyse Western blot.

L'amyline humaine lyophilisée (ci-dessus) a été reconstituée dans du Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) à 100 uM. Différentes concentrations ont été faites avec du Tris-HCl. À chaque instant, 50 µL de chacun ont été ajoutés dans une plaque à 96 puits avec 50 µL de 0,016 mg/mL (50,17 mM) de thioflavine T (Sigma). Les globules rouges (RBC) ont été dilués au 1:10 avec du PBS. Dans chaque puits, 50 µL de RBC dilué/capillaire ont été ajoutés. Ensuite, 50 µL de solution de ThioT à 0,016 mg/mL (préparée dans du PBS) ont été ajoutés à chaque puits. La fluorescence à 437 nm d'excitation et à 485 nm d'émission a été mesurée. La concentration finale de ThioT optimisée pour la détection de l'intensité du signal était de 50 µM. Les résultats ont été normalisés par rapport à l'apport protéique total (RFU/µg - unité de fluorescence relative/µg). Les données sont présentées sous forme de changements de pli par rapport aux rats WT (ou APP/PS1) car l'expérience n'est pas un test quantitatif (pas de normes peptidiques).

La peroxydation lipidique a été mesurée dans des cellules musculaires lisses isolées et des EC microvasculaires de cerveau de rat en culture à l'aide du protocole publié51. En bref, les cellules ont été incubées avec la sonde fluorescente acide 4,4-difluoro-5-(4-phényl-1,3-butadiényl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène-3-undécanoïque (C11 -BODIPY581/591 ; D3861 ; Invitrogen ; OR) et Liperfluo pendant 20 min à température ambiante. Après coloration, les cellules ont été lavées quatre fois et analysées avec un microscope à fluorescence.

L'expression différentielle au niveau des gènes entre les rats HIP et WT (n = 10 mâles/groupe) a été analysée pour tester si les gènes cérébraux répondent directement à l'inflammation cérébrovasculaire médiée par l'amyline après le développement de dépôts cérébrovasculaires d'amyline. L'ARN du cortex cérébral a été isolé à l'aide du kit RNeasy Mini de Qiagen (réf. 74104). Omega Bioservices a effectué les préparations et le séquençage de la bibliothèque RNAseq à l'aide de l'Illumina HiSeq 2500. Les données RNAseq ont été analysées à l'aide du logiciel PartekFlow (Partek, MO). En bref, les fichiers RNAseq fastq ont été importés, alignés sur le génome de référence du rat (Rattus norvegicus-rn7) et quantifiés au niveau du gène à l'aide de l'annotation Ensembl105. Les nombres de lectures RNAseq ont été normalisés et analysés plus en détail pour l'expression différentielle des gènes entre les groupes HIP et WT à l'aide de l'algorithme DESeq2. L'abondance des transcrits d'ARN de 403 gènes avait des valeurs P ≤ 0, 05 entre les groupes HIP et WT. Ces gènes différentiellement exprimés (DE) ont été interrogés pour un enrichissement des voies canoniques à l'aide du logiciel Ingenuity Pathway Analyses (IPA, Qiagen) et en outre pour l'enrichissement dans les processus biologiques Gene Ontology (GO) de ces gènes DE à l'aide de DAVID (NIH).

Le nombre d'échantillons ou d'animaux dans chaque analyse, l'analyse statistique effectuée et les valeurs P sont rapportés dans les figures et les légendes des figures. La taille de l'échantillon pour l'étude du comportement animal a été déterminée sur la base d'une étude pilote. La taille de l'échantillon a été calculée à l'aide d'Excel avec un écart type connu, un intervalle confidentiel de 95 % et un alpha égal à 0,05. Le test de D'Agostino-Pearson et Kolmogorov-Smirnov a été utilisé pour tester la distribution de normalité des variables continues. Des comparaisons paramétriques de variables continues avec des distributions normales ont été effectuées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. La correction de Welch a été utilisée avec le test t pour tenir compte de la variance inégale des tailles d'échantillons inégales, si nécessaire. Des comparaisons paramétriques de trois groupes ou plus de moyennes de groupe ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle avec le post-test de Bonferroni. L'analyse de variance unidirectionnelle de Kruskal – Wallis a été utilisée pour les analyses de variables continues avec des distributions asymétriques et une répartition similaire entre les groupes (comme dans la Fig. S1a supplémentaire). Les relations entre deux variables continues ont été analysées par analyse de corrélation. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM ou sous forme de diagrammes en boîtes et moustaches. La différence entre les groupes était considérée comme significative lorsque P < 0,05. Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 8.1.

La réplication a été effectuée à différents moments pour vérifier la reproductibilité de la date obtenue. Les ELISA et les Western blots ont été réalisés en double par deux membres différents de l'équipe. Les données étaient reproductibles après réplication. Des analyses en aveugle par l'observateur ont été effectuées sur tous les échantillons de tissus humains ; les résultats ont été communiqués au AD Center de l'Université du Kentucky pour évaluer les relations avec la pathologie de la MA/la fonction cognitive. Les enquêteurs ont également été aveuglés dans la notation des analyses histologiques et dans les tests longitudinaux du comportement animal pour éviter les biais. Les enquêteurs n'ont pas été mis en aveugle pendant l'intervention pharmacologique (telle que les traitements amiR des cellules EC) ou l'injection (amyline humaine chez les rats AKO) car les interventions ont été effectuées par le même personnel. Les enquêteurs n'ont pas été mis en aveugle pendant la plupart des essais biochimiques car cela n'est pas nécessaire. La collecte des données a été effectuée en même temps pour les groupes expérimentaux avec le même cadre.

Tous les anticorps utilisés dans ce manuscrit sont bien établis par les fabricants et d'autres publications. Nous avons effectué la validation de l'anticorps amyline dans cette étude.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Les graphiques sous-jacents aux données sources sont disponibles sous forme de fichiers « Figure de données supplémentaires ». Des images de bot non recadrées et non éditées sont disponibles en tant que Fig. 6 supplémentaire. Les données sources pour toutes les figures sont fournies dans un seul fichier Excel en tant que «Données supplémentaires 1». Les données RNAseq discutées dans cette publication ont été déposées dans Gene Expression Omnibus du NCBI et sont accessibles via le numéro d'accession GEO Series GSE221450.

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Financement en partie par : University of Kentucky Research Alliance to Reduce Diabetes-Associated Microvascular Dysfunction (ADAM) et National Institutes of Health R01 NS116058, R01 AG057290, R01 AG053999, R01 HL 149127 et P30 AG028383, et Alzheimer's Association VMF-15-363458. UK Dementia Research Institute qui reçoit son financement de DRI Ltd, financé par : le UK Medical Research Council, Alzheimer's Society et Alzheimer's Research UK ; Conseil de la recherche médicale (numéro de prix MR/N026004/1) ; Wellcome Trust Hardy (numéro de prix 202903/Z/16/Z); Fonds familial Dolby ; Institut national de recherche en santé University College London Hospitals Centre de recherche biomédicale; BRCNIHR Centre de recherche biomédicale de l'University College London Hospitals NHS Foundation Trust et de l'University College London. HL a été soutenu par une bourse de l'American Heart Association (18PRE33990154). TL est soutenu par une bourse senior d'Alzheimer's Research UK. HZ est un boursier Wallenberg soutenu par des subventions du Conseil suédois de la recherche (# 2018-02532), du Conseil européen de la recherche (# 681712 et # 101053962), du soutien de l'État suédois à la recherche clinique (# ALFGBG-71320), de la Alzheimer Drug Discovery Foundation (ADDF), États-Unis (#201809-2016862), le Fonds stratégique AD et l'Association Alzheimer (#ADSF-21-831376-C, #ADSF-21-831381-C et #ADSF-21-831377-C), le Fondation Olav Thon, la Fondation de la famille Erling-Persson, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Hjärnfonden, Suède (#FO2019-0228), le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 860197 (MIRIADE), la Programme conjoint de l'Union européenne - Recherche sur les maladies neurodégénératives (JPND2021-00694) et l'Institut britannique de recherche sur la démence de l'UCL (UKDRI-1003).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan.

Département de pharmacologie et des sciences nutritionnelles, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan, Edric Winford, Han Coburn, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa, Kuey C. Chen & Florin Despa

Centre de recherche sur le métabolisme sain, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Nirmal Verma, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa & Florin Despa

Département de neurosciences, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Edric Winford et Florin Despa

Laboratoire de génomique UKHC, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Kuey C.Chen

Centre Sanders-Brown sur le vieillissement, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Linda J. Van Eldik, Peter T. Nelson, Donna M. Wilcock et Gregory A. Jicha

Département de physiologie, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Donna M. Wilcock

Département de neurologie, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

Gregory A. Jicha, Ann M. Stowe, Larry B. Goldstein et Florin Despa

Centre d'imagerie et de spectroscopie par résonance magnétique, Université du Kentucky, Lexington, KY, États-Unis

David K.Powell

Installation RMN, Université de Californie, Davis, Californie, États-Unis

Jeffrey H. Walton

Département de pharmacologie, Université de Californie, Davis, Californie, États-Unis

Navette Manuel F.

Département de médecine, Université de Louisville, Louisville, KY, États-Unis

Matthieu A. Nystoriak

Département de physiologie, développement et neurosciences, Université de Cambridge, Cambridge, CB2 3EG, Royaume-Uni

Andrew J.Murray

Département de neurologie, Centre médical universitaire d'Utrecht, Utrecht, Pays-Bas

Geert-Jan Biessels

Département de neurosciences fondamentales et cliniques, King's College London, Londres, Royaume-Uni

Claire Troakes

Département de psychiatrie et de neurochimie, Institut de neurosciences et de physiologie, Académie Sahlgrenska de l'Université de Göteborg, Mölndal, Suède

Henrik Zetterberg

Laboratoire de neurochimie clinique, Hôpital universitaire Sahlgrenska, Mölndal, Suède

Henrik Zetterberg

Département des maladies neurodégénératives, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londres, WC1N 3BG, Royaume-Uni

Henrik Zetterberg, John Hardy et Tammaryn Lashley

Institut britannique de recherche sur la démence à l'UCL et Département des maladies neurodégénératives, Institut de neurologie de l'UCL, University College London, Londres, Royaume-Uni

Henrik Zetterberg et John Hardy

Reta Lila Weston Institute, UCL Queen Square Institute of Neurology, 1 Wakefield Street, Londres, WC1N 1PJ, Royaume-Uni

Jean Hardy

UCL Movement Disorders Centre, University College London, Londres, Royaume-Uni

Jean Hardy

Institute for Advanced Study, Université des sciences et technologies de Hong Kong, RAS de Hong Kong, Chine

Jean Hardy

Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders, Department of Clinical and Movement Neuroscience, UCL Queen Square Institute of Neurology, Londres, Royaume-Uni

Tammaryn Lashley

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NV - immunohistochimie, cytométrie en flux, microscopie confocale, STORM, isolement des capillaires cérébraux et des artères ; GVV - Analyse Western blot LRP1 et expériences BBB in vitro ; EW – cytométrie en flux et traitement des tissus cérébraux pour les analyses RNAseq ; DK, NL et LR – génotypage du rat, collecte et traitement des tissus, ELISA ; HC – comportement du rat, dosage Th-T dans le sang de rat ; DKP et JHW – expériences IRM et ASL ; KCC - analyse de données RNAseq ; SD – Isolement des CML et analyse par microscopie confocale du stress oxydatif dans les CML isolées ; AMS - formation en cytométrie en flux de EW et analyse des données de cytométrie en flux ; LVE - protocole expérimental de neuroinflammation ; AJM – protocole expérimental de régulation de l'arginase-NO vasculaire ; MFN et MAN - expériences de myographie de pression ; GAJ, PTN, DMW, LVE, HZ, CT, TL et JH – ont fourni des échantillons humains ; GAJ, LGB, PTN, JH, HZ, TL, GJB et FD - interprétation de la pathologie amyline-Aβ ; FD – conceptualisation, ressources, analyse des données et rédaction du manuscrit, tous les autres auteurs ont contribué à la forme finale du manuscrit.

Correspondance à Florin Despa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Chengbiao Wu et l'autre examinateur, anonyme, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur principal de la manipulation : Joao Valente. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Verma, N., Velmurugan, GV, Winford, E. et al. Altération de l'efflux Aβ et inflammation liées à l'accumulation cérébrovasculaire d'amyline formant de l'amyloïde sécrétée par le pancréas. Commun Biol 6, 2 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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Reçu : 08 juillet 2022

Accepté : 21 décembre 2022

Publié: 03 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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