Les levures à fission Srr1 et Skb1 favorisent la formation d'isochromosomes au centromère

Apr 11, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 551 (2023) Citer cet article

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Rad51 maintient l'intégrité du génome, tandis que Rad52 provoque une recombinaison homologue non canonique conduisant à des réarrangements chromosomiques bruts (GCR). Ici, nous constatons que la levure de fission Srr1/Ber1 et Skb1/PRMT5 favorisent les GCR au niveau des centromères. Les analyses génétiques et physiques montrent que les mutations srr1 et skb1 réduisent la formation d'isochromosomes médiée par les répétitions inversées du centromère. srr1 augmente la sensibilité aux dommages de l'ADN dans les cellules rad51 mais n'abolit pas la réponse au point de contrôle, ce qui suggère que Srr1 favorise la réparation de l'ADN indépendante de Rad51. srr1 et rad52 de manière additive, tandis que skb1 et rad52 réduisent épistatiquement les GCR. Contrairement à srr1 ou rad52, skb1 n'augmente pas la sensibilité aux dégâts. Skb1 régule la morphologie cellulaire et le cycle cellulaire avec Slf1 et Pom1, respectivement, mais ni Slf1 ni Pom1 ne provoquent de GCR. La mutation des résidus conservés dans le domaine arginine méthyltransférase de Skb1 réduit considérablement les GCR. Ces résultats suggèrent que, par méthylation de l'arginine, Skb1 forme des structures d'ADN aberrantes conduisant à des GCR dépendants de Rad52. Cette étude a découvert les rôles de Srr1 et Skb1 dans les GCR au niveau des centromères.

Des réarrangements chromosomiques bruts (GCR), tels que des translocations, peuvent se produire en utilisant des séquences répétitives qui sont abondantes et répandues dans les génomes eucaryotes1. Chez l'homme, le nombre total de séquences répétitives, y compris les répétitions satellites et les éléments transposables, représente 54 % du génome2,3. Les GCR provoquent la mort cellulaire et des troubles génétiques, y compris le cancer. D'autre part, les GCR peuvent être un moteur d'évolution en créant une diversité génomique4. Par conséquent, les GCR ne sont pas seulement des phénomènes pathologiques mais aussi physiologiques.

Le centromère qui assure une ségrégation correcte des chromosomes contient des séquences d'ADN répétitives chez de nombreux eucaryotes. Les centromères humains (≥ 3 Mb) contiennent des satellites α et d'autres types de répétitions satellites, des éléments transposables et des duplications segmentaires5. L'orientation des répétitions du centromère, y compris les répétitions d'ordre supérieur des satellites α, change au sein d'un centromère, formant des répétitions d'ADN inversées. Malgré le rôle important dans la ségrégation des chromosomes, le centromère est un point chaud pour la rupture et le réarrangement chromosomiques6,7,8,9,10. La recombinaison entre des séquences répétitives au niveau du centromère forme des chromosomes anormaux11,12,13. Les translocations robertsoniennes, une fusion de deux chromosomes acrocentriques au niveau ou autour des centromères, sont la forme d'anomalie chromosomique la plus fréquemment observée chez l'homme, affectant 1 nouveau-né sur 100014. Les isochromosomes dont les bras sont des images miroir les uns des autres se trouvent couramment dans les cellules cancéreuses15. Les isochromosomes de chr21 et chrX provoquent respectivement les syndromes de Down et de Turner16,17. Comparés aux centromères de mammifères, les centromères de levure de fission S. pombe sont courts (35 ~ 110 kb) mais contiennent des répétitions d'ADN inversées flanquant une séquence centrale non répétitive18,19. Dans ce champignon, les isochromosomes sont produits à l'aide de répétitions d'ADN inversées dans le centromère20,21,22. La moindre complexité de la séquence d'ADN du centromère fait de la levure de fission un excellent système pour étudier le mécanisme des GCR centromériques.

La recombinaison homologue est nécessaire pour réparer les dommages préjudiciables à l'ADN tels que les cassures double brin23. Rad51 est l'acteur clé de la recombinaison homologue canonique et catalyse la recherche d'homologie et l'échange de brins d'ADN, formant des boucles de déplacement. Les mammifères BRCA1 et BRCA2 facilitent la recombinaison dépendante de Rad51, et leurs mutations augmentent les GCR et prédisposent les porteurs au cancer24,25. La recombinaison homologue maintient l'intégrité du centromère. Chez les mammifères, l'inactivation de Rad51 augmente la recombinaison aberrante au niveau des centromères9,10,26. Dans la levure de fission, la perte de Rad51 augmente la formation d'isochromosomes au niveau des centromères20,21,27. Une analyse détaillée à l'aide de levure de fission a montré que Rad51 favorise préférentiellement une voie conservatrice de recombinaison : la recombinaison non croisée au niveau des centromères27,28, supprimant ainsi la formation d'isochromosomes.

Une autre recombinase Rad52 favorise la recombinaison/réparation de l'ADN dépendante de l'homologie indépendamment de Rad5129,30. Rad52, à lui seul, favorise la formation de boucles de déplacement, le recuit simple brin (SSA) et l'échange de brins inverses à l'aide de brins d'ARN. La levure Rad52 facilite également le chargement de Rad51 sur l'ADN simple brin recouvert de protéine de réplication A (RPA), tandis que la Rad52 humaine n'a pas l'activité de charge31. Chez les mammifères et la levure de fission, la recombinaison non canonique dépendante de Rad52 provoque des GCR au niveau des centromères9,32. Dans la levure de fission, Rad52 provoque la formation d'isochromosomes par recombinaison croisée avec Mus81, une endonucléase spécifique de croisement27,32,33,34,35. L'ubiquitination de PCNA au niveau de la lysine 107 et de Msh2-Msh3 a été impliquée dans la voie GCR dépendante de Rad5232,36. La pince coulissante d'ADN PCNA peut former des structures d'ADN conduisant à des GCR dépendants de Rad52 car PCNA K107 est indispensable pour la réparation des dommages à l'ADN36. La délétion de rad52 n'élimine pas la formation d'isochromosomes, suggérant la présence d'une ou plusieurs voies GCR indépendantes de Rad52. De plus, l'événement initial qui conduit aux GCR reste incertain.

Pour mieux comprendre le mécanisme GCR, nous recherchons les facteurs qui causent les GCR dans la souche mutante rad51Δ et trouvons Srr1 et Skb1. Chez A. thaliana et la souris, l'homologue de Srr1 affecte la transcription des gènes impliqués dans le rythme circadien37,38,39. Skb1 est impliqué dans une gamme de voies, y compris la morphologie cellulaire et la régulation du cycle cellulaire dans la levure de fission40,41,42,43, et est l'homologue de la protéine humaine arginine méthyltransférase 5 (PRMT5)44,45. Srr1 et Skb1 favorisent spécifiquement la formation d'isochromosomes. Remarquablement, la mutation srr1 augmente la sensibilité aux dommages de l'ADN et la perte de chromosomes, mais n'est pas essentielle pour la réponse du point de contrôle aux dommages à l'ADN, ce qui suggère que Srr1 favorise la réparation des dommages à l'ADN. Les mutations srr1 et rad52 ont réduit de manière additive les taux de GCR, suggérant que Srr1 et Rad52 ont des rôles qui se chevauchent et ne se chevauchent pas dans les GCR. Contrairement à srr1, la suppression de skb1 n'augmente pas la sensibilité aux dommages de l'ADN et, curieusement, réduit la perte de chromosomes dans les cellules rad51Δ. La perte de Slf140,41 ou Pom142,43, qui fonctionne avec Skb1 dans la morphologie cellulaire et la régulation du cycle cellulaire, n'a pas réduit les GCR. Cependant, la mutation des résidus conservés dans le domaine de l'arginine méthyltransférase (RMTase) de Skb1 a fortement réduit les GCR, ce qui suggère que Skb1 provoque la formation d'isochromosomes grâce à son activité RMTase. Ces découvertes ouvrent de nouvelles voies pour déchiffrer le mécanisme des événements GCR au centromère.

Pour mieux comprendre le mécanisme des GCR, nous avons introduit des mutations aléatoires dans les cellules rad51Δ qui affichent des taux de GCR élevés et avons recherché les clones qui présentent des niveaux réduits de GCR. Pour détecter des GCR autrement mortels dans des cellules haploïdes, nous avons utilisé un ChLC extra-chromosomique (~ 530 kb) dérivé du chromosome 3 de la levure de fission (chr3) et détecté des GCR spontanés qui avaient perdu les gènes marqueurs ura4 + et ade6 + (Fig. 1a) 20,27,46. Pour évaluer les taux de GCR, des clones de levure cultivés sur un milieu minimum d'Edimbourg additionné d'uracile et d'adénine (EMM + UA) ont été répliqués sur le milieu contenant de l'acide 5-fluoroorotique (5-FOA + UA) toxique pour les cellules ura4 +. Sur 24 000 clones, trois présentaient de manière reproductible des niveaux réduits de GCR. Le séquençage du génome de l'un d'entre eux a identifié les mutations srr1/ber1-W157R et skb1-A377V dans leurs domaines de type SRR1 et arginine méthyltransférase (RMTase), respectivement (Fig. 1b). Les gènes srr1 et skb1 ne sont distants que de 51 kb sur chr2. Le test de placage de répliques montre que, par rapport à la souche parentale rad51Δ, le clone rad51Δ contenant les mutations srr1 et skb1 du nombre réduit de colonies sur la plaque 5-FOA + UA (Fig. 1c).

a Représenté est un ChLC extra-chromosome utilisé pour détecter les GCR dans cette étude. Des GCR résultant en Leu+ Ura– Ade– à partir de Leu+ Ura+ Ade+ ont été détectés. b Les protéines Srr1/Ber1 et Skb1 contiennent respectivement le domaine de type SRR1 et le domaine arginine méthyltransférase (RMTase). Alignées sont les séquences d'acides aminés autour des mutations srr1-W157R et skb1-A377V (cercles bleus) chez différentes espèces. Les résidus similaires et identiques parmi les différentes espèces sont mis en évidence respectivement en gris pâle et gris foncé. c La souche parentale rad51∆ et le clone contenant en outre les mutations srr1-W157R et skb1-A377V (TNF5411 et 5954) cultivés sur EMM + UA ont été répliqués sur des plaques 5-FOA + UA. Les cellules Leu+ Ura– forment sélectivement des colonies sur des plaques 5-FOA+UA. d Taux de GCR des souches de type sauvage, srr1∆, skb1∆, rad51∆, srr1∆ rad51∆, skb1∆ rad51∆ et srr1∆ skb1∆ rad51∆ (TNF5369, 5774, 5772, 5411, 5904, 5788 et 8432). e Taux GCR de type sauvage, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆ (TNF8344), skb1∆ rad51∆, skb1-A377V rad51∆ (TNF8359) et srr1-W157R skb1-A377V rad51∆ (TNF8547). Chaque point représente une valeur obtenue à partir d'une expérience indépendante. Les lignes noires montrent la médiane. Les taux relatifs au type sauvage sont affichés au-dessus de chaque groupe de points. Le test de Mann-Whitney bilatéral entre les souches de type sauvage et mutantes et entre les paires indiquées. ns, non significatif ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****, p < 0,0001. Les données numériques sous-jacentes aux graphiques d et e sont fournies dans le tableau A des données supplémentaires 1.

Pour déterminer si Srr1 ou Skb1 est requis pour les GCR, nous avons supprimé les gènes et déterminé les taux de GCR par le test de fluctuation (Fig. 1d). Dans le contexte de type sauvage, srr1Δ mais pas skb1Δ ont légèrement réduit les taux de GCR, ce qui montre que Srr1 est nécessaire pour les GCR même en présence de Rad51. À notre grande surprise, non seulement srr1Δ mais aussi skb1Δ ont réduit les taux de GCR dans le fond rad51Δ, démontrant que Srr1 et Skb1 provoquent des GCR. Remarquablement, la double mutation srr1Δ skb1Δ a davantage réduit les GCR que les mutations simples, ce qui suggère que Srr1 et Skb1 ont des rôles qui ne se chevauchent pas dans les GCR (voir ci-dessous). Pour déterminer si les mutations ponctuelles srr1-W157R et skb1-A377V réduisent les taux de GCR, nous avons introduit chaque mutation dans la levure par transformation (voir Méthodes) et déterminé les taux de GCR dans le fond rad51Δ (Fig. 1e). srr1-W157R a réduit les taux de GCR bien que moins important que srr1Δ, suggérant une activité résiduelle de la protéine mutante Srr1. Contrairement à skb1Δ, skb1-A377V n'a pas réduit de manière significative les taux de GCR dans les cellules srr1 + rad51Δ. Cependant, skb1-A377V a réduit les taux de GCR dans les cellules srr1-W157R rad51Δ, suggérant que skb1-A377V inactive partiellement la fonction Skb1. L'effet additif de srr1-W157R et skb1-A377V sur les taux de GCR peut expliquer pourquoi notre dépistage génétique a identifié les deux mutations dans le même clone. Ces résultats sont cohérents avec l'idée que Srr1 et Skb1 ont des rôles qui ne se chevauchent pas dans les GCR.

Les cellules de levure bourgeonnante srr1/ber1Δ (résistantes au bénomyl) sont hyper résistantes aux composés benzimidazoles déstabilisateurs des microtubules : bénomyl et nocodazole39. Cependant, les cellules srr1Δ de levure de fission n'étaient pas plus résistantes que le type sauvage au thiabendazole (TBZ), le benzimidazole le plus populaire utilisé dans ce champignon (Fig. 1 supplémentaire). Sur cette base, nous avons décidé d'appeler ce gène srr1 plutôt que ber1 pour éviter toute confusion.

Des études antérieures ont montré que les cellules rad51Δ produisent des isochromosomes et relativement peu de troncatures chromosomiques27,32,36. Les isochromosomes sont produits à l'aide de répétitions d'ADN inversées au niveau du centromère, tandis que les troncatures chromosomiques sont formées par l'ajout de novo de séquences de télomères aux nouvelles extrémités chromosomiques (Fig. 2a). Les isochromosomes (300~400 kb) et les troncatures (< 220 kb) se distinguent les uns des autres par leurs longueurs. Pour déterminer les causes des GCR Srr1 et Skb1, les ADN chromosomiques des clones GCR parentaux et indépendants ont été préparés dans des bouchons d'agarose, séparés par électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE) et colorés au bromure d'éthidium (Fig. 2b). Les tailles des produits GCR ont été déterminées en utilisant la ChLC parentale (530 kb) et l'échelle d'ADN lambda (λ) comme références. Les cellules rad51Δ ont produit de nombreux isochromosomes (300 ~ 400 kb) et un petit nombre de troncatures (< 220 kb), comme observé précédemment20,27,32,36. La perte de Srr1 ou Skb1 a réduit la proportion d'isochromosomes parmi les produits GCR. Les taux totaux de GCR ont été multipliés par la proportion d'isochromosomes ou de troncatures (tableau 1) pour obtenir les taux d'isochromosomes et de troncatures, respectivement (Fig. 2c). Soit srr1Δ soit skb1Δ a éliminé environ 90% des isochromosomes formés dans les cellules rad51Δ, mais ni l'un ni l'autre n'a réduit les troncatures chromosomiques. Ces données indiquent que Srr1 et Skb1 sont spécifiquement nécessaires à la formation des isochromosomes au niveau du centromère.

a Sont représentées les séquences non répétitives (cnt3) et répétitives (les plus internes imr3, dg, dh et les plus externes irc3) dans cen3. Le gène marqueur ura4+ est placé à 10 kb de cen3. La perte de Rad51 augmente les isochromosomes et les troncatures chromosomiques. b Les ADN chromosomiques préparés à partir des clones GCR parentaux (P) et indépendants des souches rad51∆, srr1∆ rad51∆ et skb1∆ rad51∆ (TNF5411, 5904 et 5788) ont été séparés par PFGE. Les tailles des échelles d'ADN lambda (λ) sont indiquées à gauche des panneaux. Les nombres d'échantillons d'isochromosomes et de troncatures sont indiqués en bleu et magenta, respectivement. c Taux de formation d'isochromosomes et de troncature chromosomique dans les souches de type sauvage (TNF5369), rad51∆, srr1∆ rad51∆, skb1∆ rad51∆ et skb1-F319Y rad51∆ (TNF8391). Les taux relatifs à la déformation rad51∆ sont indiqués en haut des barres. Le test exact de Fischer à deux queues entre le rad51∆ et d'autres souches mutantes. **p < 0,01 ; ****p < 0,0001. Les données numériques sous-jacentes à c sont fournies dans le tableau B des données supplémentaires 1. Les images de gel non recadrées sont présentées dans la Fig. 5 supplémentaire.

Comme Srr1 et Skb1 favorisent la formation d'isochromosomes médiée par des répétitions de centromères, ils pourraient être impliqués dans la réparation par recombinaison des dommages à l'ADN. Pour tester cette possibilité, nous avons effectué un test de dilution en série et déterminé la sensibilité des souches mutantes srr1 et skb1 aux agents endommageant l'ADN (Fig. 3a). Le méthanesulfonate de méthyle (MMS) est un agent alkylant de l'ADN ; l'hydroxyurée (HU) épuise le pool de dNTP ; la camptothécine (CPT) est un inhibiteur de la topoisomérase. Ces agents interfèrent avec la progression des fourches de réplication et créent des cassures d'ADN. Par rapport au type sauvage, les cellules srr1Δ présentaient une hypersensibilité à tous les agents endommageant l'ADN (Fig. 3a, panneaux supérieurs). Notamment, les cellules srr1Δ rad51Δ étaient plus sensibles que les mutants simples, suggérant un rôle pour Srr1 dans la réponse aux dommages à l'ADN indépendante de Rad51. La mutation srr1-W157R qui a partiellement réduit les taux de GCR (Fig. 1e) a également partiellement augmenté la sensibilité aux dommages. Ces résultats suggèrent que Srr1 facilite la réponse aux dommages à l'ADN indépendante de Rad51.

a Un test de dilution en série pour déterminer la sensibilité aux agents endommageant l'ADN. Des cultures en phase log de type sauvage, srr1-W157R, srr1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ et srr1Δ rad51Δ (TNF3885, 8280, 5847, 5845, 8573 et 5849) préparées dans du milieu YE3S ont été déposées sur YE3S plaques complétées avec les concentrations indiquées de MMS, HU ou CPT (panneaux supérieurs). Des cultures en phase logarithmique de type sauvage, skb1Δ, rad51Δ et skb1Δ rad51Δ (TNF35, 8321, 8107 et 8320) préparées dans du milieu YE ont été déposées sur des plaques YE (panneaux inférieurs). b Les cellules de type sauvage, srr1Δ, skb1Δ et chk1Δ (TNF35, 5943, 8321 et 3559) en phase logarithmique dans EMM ont été traitées avec 0, 01% de MMS. Le pourcentage de cellules contenant un septum est indiqué. > 300 cellules sont comptées à chaque point. Le test Chi-carré de Pearson de l'indice de septation entre les souches de type sauvage et les autres souches à t = 8 h a montré que srr1Δ ou skb1Δ ne modifiait pas significativement l'indice de septation (p> 0, 05) mais que chk1Δ l'augmentait. c Phosphorylation de Chk1 en réponse au traitement au MMS. Avant et après 4 h de traitement avec 0,01 % de MMS, des extraits ont été préparés à partir de cellules chk1+ (TNF7555) et chk1-HA+ de type sauvage, srr1Δ et skb1Δ (TNF8441, 8799 et 8802) et séparés par 8 % SDS-PAGE. Chk1-HA a été détecté par Western blot en utilisant des anticorps anti-HA (16B12). Les protéines entières ont été colorées en utilisant du bleu brillant de Coomassie. Les marqueurs de taille (Takara, 3454 A, échelle de protéines clairement colorées) sont indiqués à gauche. wt, type sauvage. Les images non recadrées sont présentées dans la Fig. 6 supplémentaire. d Des cellules de type sauvage et srr1Δ (TNF5369 et 5774) ont été étalées sur des plaques YE limitées en adénine, sur lesquelles les cellules ade6– forment des colonies rouges. e Taux de perte de chromosomes des souches de type sauvage srr1Δ, srr1-W157R, skb1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ et skb1Δ rad51Δ (TNF5369, 5774, 8308, 5772, 5411, 8344 et 57 88). Le test bilatéral de Mann-Whitney. **p < 0,01 ; ***p < 0,001. Les données numériques sous-jacentes à b, e sont fournies dans les tableaux C et D, respectivement, dans les données supplémentaires 1.

L'arrêt du cycle cellulaire causé par le point de contrôle des dommages à l'ADN donne aux cellules le temps de réparer l'ADN. Pour déterminer si Srr1 est nécessaire pour arrêter la progression du cycle cellulaire en réponse aux dommages à l'ADN, nous avons déterminé le pourcentage de cellules cloisonnées avant et après exposition au MMS (Fig. 3b). Chez le type sauvage, l'indice de septation a diminué d'environ 30 à 5 % après l'exposition au MMS, démontrant l'arrêt du cycle cellulaire induit par le MMS. La kinase de point de contrôle Chk1 est requise pour l'arrêt du cycle cellulaire47. Dans la souche chk1Δ, l'indice de septation n'a pas diminué au niveau de type sauvage. Contrairement à chk1Δ, dans la souche srr1Δ, l'indice de septation a diminué au niveau de type sauvage 6 h après l'ajout de MMS, ce qui suggère que Srr1 est indispensable pour l'arrêt du cycle cellulaire. Un retard dans la réduction des cellules cloisonnées peut être dû à la croissance lente de la souche srr1Δ. Le temps de doublement des cellules de type sauvage et srr1Δ cultivées dans un milieu EMM à 30 ° C était de 2, 48 ± 0, 11 et 2, 73 ± 0, 10 h, respectivement (p = 0, 042, test t de l'étudiant bilatéral) (tableau E dans les données supplémentaires 1). Comme les cellules de type sauvage, les cellules srr1Δ ont été allongées après exposition au MMS (Fig. 2a supplémentaire). Ces données suggèrent que Srr1 est indispensable pour l'arrêt du cycle cellulaire induit par des dommages à l'ADN. La kinase Chk1 est phosphorylée et activée en réponse aux dommages à l'ADN48,49. Pour déterminer si Srr1 est nécessaire à la phosphorylation de Chk1, Chk1-HA marqué par HA a été exprimé à partir du locus chromosomique d'origine, séparé par SDS-PAGE et détecté à l'aide d'anticorps anti-HA (Fig. 3c). Une bande Chk1-HA à migration lente indicative de la phosphorylation48 a été observée lors du traitement au MMS dans les souches de type sauvage et srr1Δ, montrant que Srr1 n'est pas essentiel pour l'activation du point de contrôle des dommages à l'ADN.

La réparation des dommages spontanés à l'ADN est essentielle au maintien des chromosomes. Pour déterminer si Srr1 est nécessaire pour maintenir les chromosomes, nous avons déterminé les taux de perte spontanée de ChLC par le test de fluctuation. Une colonie formée sur des plaques YE3S a été mise en suspension dans de l'eau stérilisée et les cellules ont été étalées sur des plaques YE limitées en adénine, sur lesquelles les cellules dépourvues d'ade6 + ont formé des colonies rouges50 (Fig. 3d). Les colonies rouges ont ensuite été inspectées pour l'auxotrophie de Leu et Ura afin d'obtenir le taux de perte de chromosomes (c'est-à-dire Leu – Ura – Ade –) (Fig. 3e). Nous avons constaté que srr1Δ et srr1-W157R augmentaient le taux de perte de chromosomes. rad51Δ augmente également la perte de chromosomes, comme observé précédemment32. Notamment, srr1-W157R et rad51Δ ont augmenté de manière synergique la perte de chromosomes, démontrant que Srr1 et Rad51 ont des rôles différents dans le maintien des chromosomes.

Contrairement aux mutations srr1, skb1Δ n'a pas augmenté la sensibilité aux agents endommageant l'ADN en présence ou en l'absence de Rad51 (Fig. 3a, panneaux du bas), ce qui montre que Skb1 est indispensable pour réparer les dommages à l'ADN induits par MMS, HU ou CPT. Skb1 était également indispensable pour l'arrêt du cycle cellulaire et la phosphorylation de Chk1 induite par le traitement au MMS (Fig. 3b, c). Curieusement, cependant, skb1Δ a fortement réduit la perte de chromosomes dans les cellules rad51Δ (Fig. 3e), ce qui montre que Skb1 provoque la formation d'isochromosomes et la perte de chromosomes dans les cellules rad51Δ.

Rad52 favorise la formation d'isochromosomes dans les cellules rad51Δ. La mutation rad52-R45K dans le domaine de liaison à l'ADN N-terminal altère spécifiquement l'activité de recuit simple brin (SSA) in vitro et réduit la formation d'isochromosomes dans la même mesure que rad52Δ32, suggérant un rôle de la SSA médiée par Rad52 dans la formation d'isochromosomes. Les mutations rad52-R45K, rad52Δ et srr1Δ éliminent environ 90% des isochromosomes dans les cellules rad51Δ (Fig. 2c et réf. 32), indiquant que Rad52 et Srr1 sont essentiels pour la voie principale de formation des isochromosomes. Pour définir la relation entre Srr1 et Rad52, nous avons créé les doubles mutants srr1 rad52 et déterminé les taux de GCR (Fig. 4a). Notamment, srr1Δ et rad52-R45K ont réduit de manière additive les taux de GCR dans le contexte de type sauvage, ce qui suggère que Srr1 et Rad52 ont également des rôles qui ne se chevauchent pas dans les GCR. Conformément à cette idée, srr1-W157R et rad52-R45K ont réduit de manière additive les taux de GCR dans le fond rad51Δ. L'ubiquitination de PCNA (codée par le gène pcn1) au niveau de la lysine 107 (K107) joue un rôle dans les GCR dépendants de Rad5236. Comme prévu, srr1-W157R et pcn1-K107R ont également réduit de manière additive les taux de GCR dans les cellules rad51Δ (Fig. 4a). Ces données montrent que Srr1 et Rad52 ont des rôles qui se chevauchent et ne se chevauchent pas dans les GCR.

a Taux GCR de type sauvage, srr1∆, rad52-R45K, srr1∆ rad52-R45K, rad51∆, srr1-W157R rad51∆, rad52-R45K rad51∆, srr1-W157R rad52-R45K rad51∆, pcn1- Souches K107R rad51∆ et srr1-W157R pcn1-K107R rad51∆ (TNF5369, 5774, 6599, 8281, 5411, 8344, 7122, 8663, 6761 et 8601). Le test bilatéral de Mann-Whitney. b Analyse tétrade de srr1∆ et rad52∆. Les haploïdes srr1 :: kanR et rad52 :: hygR (TNF5943 et 7988) ont été croisés et les tétrades résultantes ont été disséquées sur des plaques YE sous un microscope. Des images de trois ensembles de tétrades viables à trois spores dans lesquelles les descendants srr1 :: kanR rad52 :: hygR n'ont pas formé de colonies sont présentées. c L'épuisement de Rad52 par le système AID altère la croissance des cellules srr1∆. rad52-AID, srr1∆ rad52-AID, OsTIRF74A, srr1∆ OsTIRF74A, rad52-AID OsTIRF74A et srr1∆ rad52-AID OsTIRF74A (TNF8614, 8621, 8616, 8623, 8617 et 8627) étaient repéré sur des plaques YE additionnées de 200 nM de 5'a-IAA qui induit une déplétion en Rad52. d Les foyers Rpa2-mCherry (pointe de flèche) ont été observés par microscopie à fluorescence dans des cellules de type sauvage (TNF5492). Les images de fluorescence et DIC sont superposées. DIC, contraste interférentiel différentiel. Une barre affichée sous l'image indique 10 µm. Le graphique à barres montre les pourcentages de noyaux contenant au moins un foyer Rpa2-mCherry dans les souches de type sauvage et srr1∆ (TNF8803). Les barres représentent la moyenne de trois expériences indépendantes. Le test t de Student bilatéral. e Des foyers Rad52-GFP (pointe de flèche) ont été observés dans des cellules de type sauvage (TNF4442). Le graphique à barres montre les pourcentages de noyaux contenant au moins un foyer Rad52-GFP dans les souches de type sauvage et srr1∆ (TNF6130). Les données numériques sous-jacentes à a sont fournies dans le tableau A, et celles sous-jacentes à d et e se trouvent dans le tableau F des données supplémentaires 1.

Nous avons croisé les souches haploïdes srr1Δ et rad52Δ et disséqué les tétrades, mais nous n'avons pas réussi à obtenir de descendances srr1Δ rad52Δ (Fig. 4b), suggérant des défauts de croissance synthétiques de la double délétion srr1 rad52. Pour confirmer cela, nous avons appauvri Rad52 dans les cellules srr1Δ en utilisant le système degron 2 induit par l'auxine (AID2)51. En présence de la protéine F-box OsTIR1F74A, un analogue de l'auxine 5'-adamantyl-IAA (5'a-IAA) induit une dégradation dépendante de la polyubiquitine de la protéine Rad52 marquée par l'AID, Rad52-AID. L'ajout de 5'a-IAA au milieu a considérablement altéré la croissance cellulaire du srr1Δ rad52-AID par rapport à la souche rad52-AID (Fig. 4c, deux dernières rangées). Ces résultats montrent des rôles non chevauchants pour Srr1 et Rad52 dans la croissance cellulaire. Compte tenu de l'hypersensibilité des cellules srr1Δ aux agents endommageant l'ADN (Fig. 3a), Srr1 peut favoriser la réparation des dommages spontanés à l'ADN. L'ADN simple brin se forme lors de la réplication, de la transcription et de la réparation/recombinaison des dommages à l'ADN. Le complexe de la protéine de réplication A (RPA) se lie à l'ADN simple brin avec une haute affinité52. Nous avons détecté la formation spontanée de foyers de Rpa2-mCherry exprimés à partir du locus chromosomique d'origine32 et avons constaté que srr1Δ augmentait la fraction de cellules contenant le foyer Rpa2-mCherry (Fig. 4d), suggérant l'accumulation d'ADN simple brin dans les cellules srr1Δ. Rad52 forme des foyers nucléaires sur les sites de dommages spontanés à l'ADN27,53. srr1Δ a également augmenté les cellules contenant le foyer Rad52-GFP (Fig. 4e), montrant que Srr1 supprime la formation du foyer Rad52.

Srr1 possède un domaine conservé au cours de l'évolution appelé domaine de type SRR1 (Fig. 5a). La structure de la protéine Srr1 prédite par les méthodes AlphaFold54,55 consiste en un domaine de type SRR1 contenant des feuillets β pris en sandwich par des hélices α avec des extensions intrinsèquement désordonnées56 aux extrémités N et C (Fig. 5b, c). Le site de mutation srr1-W157R est présent dans le domaine de type SRR1. Pour étendre cela, nous avons changé les résidus conservés dans le domaine de type SRR1 en alanine : srr1-D111A, P112A et srr1-H148A (Fig. 5a, b). Les mutations srr1-D111A, P112A et srr1-H148A ont réduit les taux de GCR (Fig. 5d). srr1-D111A, P112A et srr1-H148A ont également augmenté la sensibilité aux dommages à l'ADN (Fig. 5e). Ces résultats démontrent que le domaine de type SRR1 joue un rôle essentiel dans les GCR et la réparation des dommages à l'ADN. Comme prévu d'après le temps de doublement prolongé (tableau E dans les données supplémentaires 1), les cellules srr1Δ ont formé de petites colonies sur le milieu de la plaque par rapport aux cellules de type sauvage (Fig. 2b supplémentaire). Comme les cellules srr1Δ, les cellules srr1-W157R, srr1-D111A, P112A et srr1-H184A ont produit de petites colonies (Fig. 2b supplémentaire), ce qui correspond au rôle du domaine de type SRR1, même en l'absence de dommages exogènes à l'ADN.

a Les positions des sites de mutation de la levure de fission srr1-D111A, P112A, -H148A et -W157R sont indiquées par des cercles bleus. Les résidus similaires et identiques parmi les différentes espèces sont mis en évidence respectivement en gris pâle et gris foncé. b Un modèle en ruban de la structure Srr1 prédite par les méthodes AlphaFold. Les positions des sites de mutation sont indiquées. c Un modèle surfacique de la structure Srr1. Les résidus chargés positivement et négativement sont représentés respectivement en bleu et en rouge. d Taux GCR de type sauvage, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆, srr1-D111A, P112A rad51∆ et srr1-H148A rad51∆ (TNF5369, 5411, 5904, 8344, 8686 et 8387). Le test bilatéral de Mann-Whitney. Les données numériques sont fournies dans le tableau A des données supplémentaires 1. e La mutation des résidus conservés dans le domaine de type SRR1 augmente la sensibilité au MMS, au HU et au CPT. Des cellules de type sauvage, srr1∆, srr1-W157R, srr1-H148A et srr1-D111A, P112A (TNF3885, 5847, 8280, 8275 et 8274) ont été déposées sur YE3S complété avec les concentrations indiquées de MMS, HU ou CPT.

Skb1 a été impliqué dans un large éventail de voies, y compris la morphologie cellulaire et la régulation du cycle cellulaire. Skb1 interagit avec Slf1 et se localise dans les nœuds corticaux cellulaires en fonction de Slf1, favorisant la morphologie cellulaire en forme de bâtonnet de la levure de fission40,41. La kinase Pom1 de la famille DYRK régule négativement la progression du cycle cellulaire pour garantir que les cellules atteignent une certaine taille avant d'entrer en mitose42. Des preuves génétiques montrent que Skb1 agit dans la voie Pom1 pour réguler le cycle cellulaire indépendamment de son activité méthyltransférase43. Pour demander si Skb1 favorise la formation d'isochromosomes par ces voies, nous avons perturbé les gènes slf1 ou pom1 et déterminé les taux de GCR des souches mutantes (Fig. 6a). Contrairement à skb1Δ, slf1Δ et pom1Δ ont légèrement augmenté les taux de GCR dans le fond de type sauvage et n'ont pas réduit les taux de GCR dans le fond rad51Δ, montrant que Skb1 favorise la formation d'isochromosomes par la fonction indépendante de Slf1 ou de Pom1.

a Taux GCR des souches de type sauvage, skb1∆, slf1∆, pom1∆, rad51∆, skb1∆ rad51∆, slf1∆ rad51∆ et pom1∆ rad51∆ (TNF5369, 5772, 8811, 8813, 5411, 5 788, 8834 et 8838). b La structure du domaine arginine méthyltransférase de la levure de fission S. pombe Skb1 prédite par les méthodes AlphaFold et la structure cristalline du domaine arginine méthyltransférase de C. elegans PRMT5 (code PDB 3UA3) avec SAH, un analogue SAM sont présentées. Les positions des résidus phénylalanine (F) et acide glutamique (E) essentiels à l'activité de l'arginine méthyltransférase sont indiquées. c Taux GCR des souches de type sauvage, rad51∆, skb1∆ rad51∆, skb1-A377V rad51∆, skb1-F319Y rad51∆ et skb1-E422A,E431A rad51∆ (TNF5369, 5411, 5788, 8359, 8 391 et 8474). d Produits GCR séparés par PFGE de la souche skb1-F319Y rad51∆. Les nombres d'échantillons d'isochromosomes et de troncatures sont indiqués en bleu et magenta, respectivement. e Taux GCR des souches de type sauvage, skb1∆, rad52-R45K, skb1∆ rad52-R45K, rad51∆, skb1∆ rad51∆, rad52-R45K rad51∆ et skb1∆ rad52-R45K rad51∆ (TNF5369, 57 72, 6599, 8324, 5411, 5788, 7122 et 8345). Le test bilatéral de Mann-Whitney. Les données numériques sous-jacentes à a, c et e sont fournies dans le tableau A des données supplémentaires 1. Les images de gel non recadrées sont présentées dans la Fig. 5 supplémentaire.

Skb1 est l'homologue de PRMT5 arginine méthyltransférase (RMTase)44,45. La structure du domaine RMTase de S. pombe Skb1 prédite par les méthodes AlphaFold54,55 est très similaire à la structure cristalline du domaine RMTase PRMT5 de C. elegans (Fig. 6b) et aux structures prédites de H. sapiens, A. thaliana et S. cerevisiae Homologues Skb1/PRMT5 (Fig. 3 supplémentaire). La mutation skb1-A377V que nous avons isolée est présente dans le domaine RMTase (Figs. 1b, 6b), mais le phénotype mutant n'était pas aussi important que skb1Δ (Fig. 6c). Pour déterminer si l'activité RMTase est essentielle pour que Skb1 favorise la formation d'isochromosomes, nous avons muté les résidus Skb1 F319, E422 et E431 équivalents à ceux importants pour l'activité RMTase in vitro de C. elegans PRMT557. Nous avons constaté que les mutations skb1-F319Y et skb1-E422A, E431A réduisaient fortement les taux de GCR dans les cellules rad51Δ (Fig. 6c). Il est important de noter que la même mutation skb1-E422A,E431A n'interfère pas avec son rôle dans la régulation du cycle cellulaire43. L'analyse PFGE a montré que, comme skb1Δ, skb1-F319Y réduisait les isochromosomes mais pas les troncatures chromosomiques dans les cellules rad51Δ (figures 2c, 6d et tableau 1). Nous avons également examiné la relation entre Skb1 et Rad52 et avons constaté que skb1Δ ne réduisait pas de manière significative les taux de GCR dans les cellules rad52-R45K ou rad52-R45K rad51Δ (Fig. 6e). Ensemble, ces données indiquent que Skb1 favorise la formation d'isochromosomes dépendant de Rad52 via son activité RMTase.

Les GCR se produisent en utilisant des séquences répétitives présentes dans le génome eucaryote. Cependant, le mécanisme des GCR à médiation répétée est largement inconnu. Ici, nous avons constaté que les Srr1 et Skb1 conservés au cours de l'évolution favorisent la formation d'isochromosomes en utilisant des répétitions d'ADN inversées au centromère. Remarquablement, srr1 a augmenté la sensibilité aux dommages de l'ADN dans les cellules rad51Δ mais n'a pas aboli la réponse au point de contrôle, ce qui suggère que Srr1 favorise la réparation de l'ADN indépendante de Rad51 sujette aux GCR. Les mutations srr1 et rad52 se sont ajoutées, tandis que skb1 et rad52 ont réduit de manière épistatique les taux de GCR. Contrairement aux mutations srr1, skb1Δ n'a pas augmenté la sensibilité aux dommages de l'ADN et réduit la perte de chromosomes dans les cellules rad51Δ. Grâce à l'activité RMTase, Skb1 pourrait former des structures d'ADN conduisant à des GCR dépendants de Rad52.

Srr1 et Skb1 favorisent la formation d'isochromosomes au centromère. Nous avons trouvé les mutations srr1-W157R et skb1-A377V dans le même clone qui présente des niveaux de GCR réduits (Fig. 1c). La suppression de srr1 ou de skb1 a réduit les taux de GCR dans les cellules rad51Δ (Fig. 1d), ce qui indique que Srr1 et Skb1 favorisent les GCR. Srr1 semble plus intégré aux GCR que Skb1 car srr1Δ mais pas skb1Δ ont réduit les taux de GCR même en présence de Rad51 (Fig. 1d). L'analyse physique des produits GCR a montré que Srr1 et Skb1 sont responsables d'environ 90% des isochromosomes produits dans les cellules rad51Δ mais indispensables pour les troncatures chromosomiques (Fig. 2c). Étant donné que les points de rupture des isochromosomes sont présents dans la répétition du centromère20, ces résultats indiquent que Srr1 et Skb1 favorisent les GCR médiés par la répétition au centromère. Que Srr1 ou Skb1 provoque des GCR en dehors du centromère reste à élucider. Les mutations srr1 et skb1 ont réduit de manière additive les taux de GCR dans les cellules rad51Δ (Fig. 1d, e), suggérant que Srr1 et Skb1 ont des rôles qui ne se chevauchent pas dans les GCR (voir ci-dessous).

Comment Srr1 favorise-t-il la formation d'isochromosomes ? Nous proposons que Srr1 favorise la réparation des dommages à l'ADN sujets aux GCR. Dans le type sauvage, Rad51 répare principalement les dommages préjudiciables à l'ADN, tels que les cassures double brin de l'ADN, et protège l'intégrité des chromosomes. Cependant, en l'absence de Rad51, les dommages à l'ADN non réparés seront canalisés vers d'autres voies de réparation, telles que la voie de recombinaison dépendante de Rad5229,30. Srr1 est impliqué dans la réponse aux dommages à l'ADN indépendante de Rad51, car les mutations srr1 et rad51 ont augmenté de manière additive la sensibilité au MMS, HU ou CPT (Figs. 3a, 5e). Srr1 n'était pas essentiel pour l'arrêt du cycle cellulaire induit par le MMS et la phosphorylation de Chk1 (Fig. 3b, c), ce qui suggère que Srr1 favorise la réparation des dommages à l'ADN plutôt que la réponse au point de contrôle. Ceci est cohérent avec le fait que les kinases de point de contrôle Chk1 et Rad3 suppriment mais ne favorisent pas les GCR20,58. Comme rad52Δ et rad52-R45K32, srr1Δ a éliminé environ 90% des isochromosomes dans les cellules rad51Δ (Fig. 2c), montrant que Srr1 et Rad52 sont essentiels à la voie principale de formation des isochromosomes. Cependant, Srr1 et Rad52 peuvent également avoir des rôles qui ne se chevauchent pas dans les GCR, car les mutations srr1 et rad52 ont réduit de manière additive les taux de GCR (Fig. 4a). Ceci est soutenu par l'effet additif de srr1 et skb1 (Fig. 1d, e) et l'effet épistatique de skb1 et rad52 sur les taux de GCR (Fig. 6e). srr1Δ a provoqué des défauts de croissance synthétiques avec rad52Δ et accumulé des foyers spontanés de Rpa2 et Rad52 (Fig. 4b – e). srr1Δ a augmenté le temps de doublement et produit de petites colonies par rapport au type sauvage (tableau E dans les données supplémentaires 1 ; Fig. 2b supplémentaire). Srr1 peut favoriser la réparation des dommages spontanés à l'ADN. L'hypersensibilité des cellules srr1 aux agents endommageant l'ADN le confirme, mais nous n'excluons pas la possibilité que Srr1 supprime la formation de dommages spontanés à l'ADN. Bien que sa fonction biochimique reste inconnue, nous avons trouvé le domaine de type SRR1 critique pour les GCR et la réparation des dommages à l'ADN. Les mutations srr1-D111A, P112A et srr1-H148A altérant les résidus conservés au cours de l'évolution dans le domaine de type SRR1 ont fortement réduit les taux de GCR et augmenté la sensibilité aux agents endommageant l'ADN, qui interfèrent avec la progression de la fourche et finissent par créer des ruptures d'ADN (Fig. 5). L'extension N-terminale de Srr1 est prédite intrinsèquement désordonnée dans la réf. 56 et contient des résidus chargés positivement dans la levure de fission et d'autres organismes, y compris les humains, suggérant son rôle dans l'interaction avec d'autres molécules. Fait intéressant, la comparaison de la structure des protéines à l'aide du serveur Dali59 suggère que le domaine de type SRR1 présente une similitude structurelle avec un ensemble de protéines, y compris les méthyltransférases (Données supplémentaires 2). L'inactivation du SRRD homologue de Srr1 dans les cellules de souris altère la réplication de l'ADN37, ce qui suggère que le Srr1 de mammifère joue également un rôle dans la réparation des dommages spontanés à l'ADN créés lors de la réplication de l'ADN. Chez les plantes et les mammifères, SRR1/SRRD affecte la transcription des gènes impliqués dans le rythme circadien37,38,60, ce qui soulève la possibilité que Srr1 favorise les GCR et la réponse aux dommages à l'ADN par la régulation transcriptionnelle. Fait intéressant, la mutation srr1/ber1 dans la levure bourgeonnante provoque des défauts de croissance synthétiques avec des mutations dans les protéines du centromère, y compris la variante Cse4/CENP-A39 de l'histone H3 spécifique au centromère. Bien que, contrairement aux cellules de levure bourgeonnante srr1Δ/ber1Δ, les cellules de levure de fission srr1Δ ne soient pas hyper-résistantes à un médicament déstabilisant les microtubules, il est toujours possible que Srr1 favorise la formation d'isochromosomes en affectant la structure du centromère. Srr1 a été localisé à la fois dans le noyau et dans le cytosol de la levure de fission61, mais on ne sait pas si Srr1 se localise dans le centromère. Des travaux futurs sont nécessaires pour déterminer comment Srr1 favorise la formation d'isochromosomes et la réponse aux dommages à l'ADN.

Il a été démontré qu'une mutation dans l'hélicase Fbh1 supprime les défauts de croissance et de recombinaison des cellules rad52Δ62, ce qui soulève la possibilité que des mutations fbh1 spontanées aient été introduites dans notre souche rad52Δ et affectent les GCR. Cependant, nous n'avions précédemment montré aucune mutation fbh1 dans notre souche rad52Δ rad51Δ36 utilisée pour déterminer les taux de GCR. Nous n'avons également confirmé aucune mutation fbh1 dans toutes les souches mutantes rad52 et la souche srr1Δ rad51Δ utilisée dans cette étude (Données supplémentaires 3). De plus, la suppression de fbh1 n'a pas affecté de manière significative la formation d'isochromosomes dans les cellules rad51Δ (Fig. 4 supplémentaire).

Skb1 a été impliqué dans de nombreuses voies. Cependant, nos données montrent que Skb1 favorise la formation d'isochromosomes indépendamment de son rôle dans la morphologie cellulaire et la régulation du cycle cellulaire médiée par Slf1 et Pom1, respectivement (Fig. 6a). Skb1 et Slf1 se lient et sont mutuellement nécessaires pour leur localisation aux nœuds corticaux cellulaires40. La localisation du nœud cortical n'est pas essentielle pour que Skb1 favorise la formation d'isochromosomes, car slf1Δ n'a pas réduit les taux de GCR. Dans les cellules rad51Δ, rad52-R45K réduit la formation d'isochromosomes et augmente la sensibilité aux dommages à l'ADN32. La mutation pcn1-K107R dans une pince coulissante d'ADN PCNA et rad52-R45K réduisent épistatiquement la formation d'isochromosomes, mais pcn1-K107R n'augmente pas la sensibilité aux dommages à l'ADN36. Comme pcn1-K107R, skb1Δ altère la formation d'isochromosomes dépendant de Rad52 (Fig. 6e) mais n'augmente pas la sensibilité aux dommages à l'ADN (Fig. 3a). De concert avec PCNA, Skb1 pourrait former des structures d'ADN conduisant à des GCR dépendants de Rad52. Les cellules rad51Δ ont montré des niveaux élevés de perte de chromosomes et de GCR, probablement en raison de l'incapacité à réparer les dommages spontanés à l'ADN. Comme dans le cas des GCR (Fig. 1d), skb1Δ réduit la perte de chromosomes dans rad51Δ mais pas dans les cellules de type sauvage (Fig. 3e), ce qui montre que Skb1 provoque des GCR et une perte de chromosomes dans les cellules rad51Δ. Skb1 est l'homologue de levure de fission de PRMT5 arginine méthyltransférase (RMTase)44,63. PRMT5 est surexprimé dans de nombreuses tumeurs malignes, dont le cancer du sein, et joue un rôle dans le développement du cancer64. Fait intéressant, les protéines affectant la structure et la réplication de la chromatine, telles que les histones, l'endonucléase Fen1 DNA-flap et p53, ont été trouvées en tant que substrats PRMT565,66,67,68. Skb1 interagit également avec Shk1, une kinase activée par p21 (PAK) qui régule négativement la progression du cycle cellulaire69. La mutation des résidus essentiels à l'activité RMTase : 57 skb1-F319Y et skb1-E422A, E431A a fortement réduit les taux de GCR, suggérant que Skb1 favorise les GCR via l'activité RMTase. Il est crucial d'identifier le(s) substrat(s) clé(s) de la Skb1 RMTase qui induit l'instabilité chromosomique dans le futur. Néanmoins, nos découvertes ont ouvert une nouvelle voie pour élucider le mécanisme des GCR au centromère.

Les souches de levure de fission utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1 et sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant. Les amorces d'ADN utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. Les cellules ont été cultivées dans un milieu d'extrait de levure (YE) ou dans un milieu minimal d'Edimbourg 2 (EMM) 70 à 30 ° C, sauf indication contraire. Des acides aminés ou des bases ont été ajoutés à une concentration finale de 225 mg L-1. Le milieu de base azotée de levure (YNB) contenait 7 g L-1 de base azotée de levure (BD Difco, BD 291940) et 20 g L-1 de glucose. Le milieu YNB est complété par 1 g d'acide 5-fluoroorotique L-1 (Apollo Scientific, PC4054) et 56 mg d'uracile L-1 (Nacalai Tesque, 35824–82) pour préparer le milieu 5-FOA. Les milieux solides contenaient 1,5 % d'agarose (Nacalai Tesque, 01028–85). La transformation des levures a été réalisée par la méthode acétate de lithium/PEG71. Les cellules de levure ont été cultivées dans du milieu YE ou YE3S jusqu'à la phase logarithmique (1–2 × 107 cellules mL-1) et récoltées par centrifugation. Les cellules ont été lavées une fois avec de l'eau stérilisée et deux fois avec 1 mL de tampon LiAc/TE (acétate de lithium 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM). Les cellules ont été mises en suspension dans un tampon LiAc/TE à > 2 × 109 cellules mL-1. 100 μL de la suspension cellulaire ont été mélangés avec 5 μL d'ADN de sperme de saumon (10 mg mL-1) et l'ADN d'introduction et incubés à température ambiante pendant 10 min. Après avoir ajouté 260 μL de PEG/LiAc/TE (40 % PEG4000, acétate de lithium 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM), le tube a encore été incubé pendant 30 min avec rotation. Après avoir ajouté 43 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO), le tube a été incubé à 42 °C pendant 5 min. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 503 × g pendant 30 s, mises en suspension dans du milieu YE ou YE3S et étalées sur un milieu non sélectif. Après un jour d'incubation, les cellules ont été répliquées sur un milieu additionné de G418 (Nacalai Tesque, 09380–86) ou d'hygromycine B (Nacalai Tesque, 09287–87) à une concentration finale de 100 µg mL-1 ou de clonNAT (Werner BioAgents, 5.001.000) à 50 µg mL-1 pour sélectionner les transformants. Nous n'avons pas détecté de colonies exceptionnellement grandes de mutants rad52 car ils peuvent contenir une mutation fbh162.

Pour rechercher les gènes responsables des GCR dans les cellules rad51Δ, nous avons introduit des mutations aléatoires dans la levure essentiellement, comme décrit précédemment dans la réf. 32. L'acide nitreux a été utilisé comme agent mutagène car il introduit efficacement des mutations dans les cellules déficientes en réparation de l'ADN, comme dans les cellules de type sauvage72. Les cellules rad51Δ contenant du ChLC (TNF5411) cultivées dans de l'EMM ont été collectées à la phase logarithmique (5 × 106 cellules mL-1), mises en suspension dans de l'eau et conservées pendant la nuit à 4 ° C. Après centrifugation, les cellules ont été mises en suspension dans 0,8 ml d'une solution d'acide nitreux 0,01 M préparée avant utilisation en dissolvant du nitrate de sodium (Wako, 195-20562) dans de l'acétate de sodium 0,5 M (pH 4,8) et incubées à température ambiante pendant 20 min. Après avoir ajouté un volume égal du tampon d'arrêt (3,6 % de Na2HPO4·12H20 et 1 % d'extrait de levure) à la suspension cellulaire, les cellules ont été étalées sur des plaques EMM+UA. L'efficacité de placage des cellules mutagénisées déterminée à l'aide de plaques EMM était d'environ 10 %. 24 000 clones indépendants ont été incubés sous forme de patchs sur des plaques EMM + UA pendant 2 à 3 jours à 30 ° C, puis transférés sur des plaques 5-FOA + UA pour déterminer de manière semi-quantitative le taux d'auxotrophe de l'uracile, résultant de GCR ou d'une mutation ponctuelle dans le gène ura4. 80 clones ont produit un nombre réduit de colonies sur des plaques 5-FOA+UA. L'analyse PFGE a montré que six contenaient les tailles aberrantes de la ChLC parentale. Les 74 clones restants ont été croisés avec des cellules de type sauvage contenant ChLC. Trois clones ont présenté de manière reproductible des taux de GCR réduits. Le séquençage en profondeur de l'ADN génomique a été réalisé à l'aide de MiSeq (Illumina, San Diego, CA) et les mutations ont été identifiées par une analyse de liaison groupée73,74. Les données de séquence nucléotidique de la souche parentale et d'un pool de neuf ségrégants mutants obtenus par rétrocroisement de l'un des trois clones sont disponibles dans DDBJ Sequenced Read Archive sous les numéros d'accès DRX042095 et DRX042098, respectivement.

La souche srr1 :: kanMX6 a été créée par deux cycles de réaction en chaîne par polymérase, PCR75. Les amorces srr1-kan3 et srr1-kan5 ont été conçues de telle sorte que le côté 3' soit complémentaire de srr1 et que le côté 5' soit complémentaire du gène kanMX6 sur le plasmide pFA6a-kanMX676. Dans le premier tour de PCR, les régions flanquantes de srr1 de 0,5 kb ont été amplifiées, en utilisant des paires d'amorces srr1-kan3/srr1-3 ou srr1-kan5/srr1-1 et de l'ADN génomique de levure de fission comme matrice. Le deuxième cycle de PCR a été réalisé en présence des deux fragments de PCR, pFA6a-kanMX6 et des amorces srr1-1/srr1-3, pour produire le fragment d'ADN contenant la construction srr1 :: kanMX6. Le fragment PCR de 2,5 kb a été introduit dans la levure.

La souche skb1 :: kanMX6 (ou skb1 :: hphMX6) a été créée de la même manière que celle décrite ci-dessus. Dans le premier tour de PCR, les régions flanquantes de skb1 de 0,5 kb chacune ont été amplifiées, en utilisant des paires d'amorces skb1-1/skb1-kan5 ou skb1-kan3/skb1-2. Le deuxième cycle de PCR a été réalisé en présence des deux fragments de PCR, pFA6a-kanMX6 (ou pFA6a-hphMX6), et des amorces skb1-1/skb1-2, pour produire le fragment d'ADN contenant la construction skb1 :: kanMX6 ou skb1 :: hphMX6. Le fragment PCR de 2,5 ou 2,7 kb a été introduit dans la levure.

Pour créer la souche mutante srr1-W157R, le gène ura4+ a été introduit dans le gène srr1 dans les cellules ura4-D18, créant des cellules ura4+:srr1. Lors du premier cycle de PCR, des régions de 0, 5 kb ont été amplifiées à l'aide de paires d'amorces srr1-F1 / srr1-ura4AN5 et srr1-ura4AN3 / srr1-R1. Le deuxième tour de PCR a été réalisé en présence des deux fragments de PCR, d'un plasmide contenant le fragment génomique ura4+ et des amorces srr1-F1/srr1-R1. Le fragment PCR de 3 kb a été transformé dans des cellules de levure, et les transformants ura4+ ont été sélectionnés sur milieu EMM. Ensuite, la région génomique contenant la mutation srr1-W157R a été amplifiée par PCR en utilisant des amorces srr1-1/srr1-R1 et l'ADN matrice préparé à partir du mutant srr1-W157R skb1-A377V isolé lors du criblage. Le produit PCR de 1,5 kb a été introduit dans la souche ura4+:srr1 et les transformants ura4– ont été sélectionnés sur des plaques 5-FOA. Le séquençage de l'ADN a confirmé l'intégration de la mutation srr1-W157R et aucune mutation supplémentaire. Suite à la construction de la souche ura4+:skb1, la souche skb1-A377V a été créée de la même manière, sauf que les amorces skb1-F1/skb1-2 ont été utilisées.

Le fragment mutant srr1-H148A a également été créé en deux cycles de PCR. Tout d'abord, des fragments de 0, 6 et 0, 5 kb ont été amplifiés à l'aide de paires d'amorces srr1-H148A-F / srr1-R1 et srr1-H148A-R / srr1-F1, respectivement, et d'ADN génomique de levure de fission comme matrice. Les amorces srr1-H148A-F et srr1-H148A-R contiennent la mutation srr1-H148A. Les deux fragments de PCR se chevauchant ont été joints lors du second cycle de PCR en présence des amorces srr1-F1/srr1-R1. Le produit de 1,1 kb a été introduit dans la souche ura4+:srr1 et les transformants ura4– ont été sélectionnés sur des plaques 5-FOA. Le mutant srr1-D111A,P112A a été créé d'une manière similaire. Dans le premier tour de PCR, des fragments de 0,7 et 0,5 kb ont été amplifiés à l'aide de paires d'amorces srr1-DPAA-F/srr1-R1 et srr1-DPAA-R/srr1-F1, respectivement. Les deux fragments de PCR ont été joints dans la deuxième réaction de PCR contenant les amorces srr1-F1/srr1-R1. Le produit de 1,1 kb a été introduit dans la souche ura4+:srr1. Les mutants skb1-F319Y et skb1-E422A, E431A ont été générés de la même manière en utilisant respectivement les paires d'amorces skb1-F1/skb1-F319Y-R et skb1-F319Y-F/skb1-R1, et skb1-F1/skb1-doubleE-R et skb1-doubleE-F/skb1-R1. Intégration correcte des mutations ponctuelles, mais aucune mutation supplémentaire n'a été confirmée par le séquençage de Sanger.

Les taux de GCR ont été déterminés par le test de fluctuation tel que décrit précédemment dans la réf. 36. Les cellules de levure ont été incubées sur des plaques EMM+UA pendant 6 à 8 jours. Des colonies uniques ont été utilisées pour inoculer 10 ml de milieu liquide EMM + UA. Après 1 à 2 jours d'incubation, les cellules ont été étalées sur des plaques 5-FOA + UA et YNB + UA. Après 5 à 9 jours d'incubation, les colonies formées sur 5-FOA + UA et YNB + UA ont été comptées pour déterminer le nombre de cellules Leu + Ura– et Leu +, respectivement. Environ six colonies de chaque plaque 5-FOA + UA ont été striées sur EMM + UA pour examiner la taille des colonies, puis transférées sur des plaques EMM + U pour inspecter l'auxotrophie de l'adénine. Le nombre de cellules Leu+ Ura– Ade–, indicatif de GCR, a été obtenu en soustrayant le nombre de cellules Leu+ Ura– Ade+ de celui des cellules Leu+ Ura–. Les taux de GCR par division cellulaire ont été déterminés comme décrit dans la réf. 77. Lorsque nous avons commencé les cultures de levure, nous avons prélevé au hasard des colonies de différentes tailles. Nous avons récupéré les grandes et les petites colonies sur des plaques 5-FOA + UA pour les analyses PFGE, selon le rapport de leur apparition.

Les taux de perte de chromosomes ont été déterminés par le test de fluctuation tel que décrit précédemment dans la réf. 27. Une seule colonie formée sur des plaques YE3S après 3 à 4 jours d'incubation a été mise en suspension dans de l'eau stérilisée et les cellules ont été étalées sur des plaques YE. Après 4 à 6 jours d'incubation, les colonies blanches et rouges ont été comptées. Les colonies rouges, indiquant la perte d'ade6, ont été transférées sur des plaques YE3S et EMM + UA pour inspecter l'auxotrophie de la leucine. Les colonies cultivées sur des plaques YE3S ont été répliquées sur des plaques EMM + UL et EMM + AL pour tester l'auxotrophie de l'adénine et de l'uracile, respectivement. Le nombre de cellules Leu–Ura–Ade–, indiquant la perte de chromosomes ChLC, et le nombre total de cellules formant des colonies ont été utilisés pour obtenir le taux de perte de chromosomes par division cellulaire77.

Chaque clone GCR a été obtenu à partir d'une culture indépendante pour éviter plusieurs clones du même parent. Les cellules ont été cultivées dans du milieu YE3S à 25 ° C pendant 12 à 24 h. 1 × 108 cellules ont été récoltées, mises en suspension dans 2,5 ml d'EDTA 50 mM glacé et stockées à 4 ° C. Les cellules ont été centrifugées et remises en suspension dans 1 mL de tampon CSE (phosphate citrate 20 mM, sorbitol 1 M, EDTA 50 mM (pH 5,6)). Pour préparer les sphéroplastes, 5 μL de Zymolyase 20 T (Seikagaku, Tokyo, Japon, 25 mg mL-1) et 5 μL d'enzyme de lyse (Sigma, St. Louis, Missouri, 25 mg mL-1) ont été ajoutés à la suspension cellulaire et incubés à 30 °C pendant 20 à 50 min. Les sphéroplastes ont été récoltés par centrifugation à 33 × g pendant 10 min à 4 ° C, et le culot a été mis en suspension dans 140 μL de tampon CSE. Un volume égal de gel d'agarose à bas point de fusion à 1, 6% (Nacalai Tesque, 01161–12) préchauffé à 50 ° C a été ajouté à la suspension cellulaire et distribué dans des moules. Les bouchons d'agarose ont été incubés à 4°C pendant 20 min. Les bouchons ont été incubés dans une solution SDS-EDTA (1 % SDS, 0,25 M EDTA) à 60 °C pendant 2 h puis dans une solution ESP (0,5 M EDTA, 1 % N-lauroyl sarcosine, 1,5 mM acétate de calcium) additionnée de 0,5 mg mL-1 protéinase K (Nacalai Tesque, 39450–01–6) à 50 °C pendant la nuit. Les bouchons ont été transférés dans une autre solution ESP additionnée de 0,5 mg mL-1 de protéinase K et incubés à 50 °C pendant 8 h supplémentaires. Les bouchons ont été stockés dans du tampon TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) à 4 °C. Les ADN chromosomiques ont été résolus à l'aide d'un système d'électrophorèse en champ pulsé CHEF-DRII (Bio-Rad, Hercules, Californie). PFGE a fonctionné à 4, 2 V cm -1 avec un temps d'impulsion de 40 à 70 s pendant 24 h, à 4 ° C dans un tampon TBE 0, 5 × (Tris-borate 89 mM, EDTA 2 mM) en utilisant un gel d'agarose Megabase certifié à 0, 55%. L'ADN a été coloré avec 0,2 µg mL-1 de bromure d'éthidium (EtBr) (Nacalai Tesque, 14631–94) et détecté à l'aide d'un scanner d'imagerie sur gel Typhoon FLA9000 (GE Healthcare, Chicago, Illinois) ou d'un système d'imagerie GelDoc Go (Bio-Rad, Hercules, CA). Les images de gel ont été traitées à l'aide d'ImageJ2 2.9.0 (NIH, États-Unis) ou d'Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Une seule colonie formée sur des plaques YE (ou YE3S) après 3 à 4 jours d'incubation a été utilisée pour inoculer 2 ml de milieu liquide YE (ou YE3S). La culture d'une nuit de 2 ml a été utilisée pour préparer des cultures en phase logarithmique de 10 ml. Des dilutions en série au quintuple des souches indiquées ont été préparées avec de l'eau stérilisée. 6 µL de chaque dilution ont été déposés sur des plaques YE (ou YE3S) additionnées de la concentration indiquée de MMS, HU, CPT ou TBZ. Les plaques ont été incubées pendant 3 à 5 jours à 30 °C. Les images ont été prises avec GT-X800 (Epson, Nagano, Japon) et traitées avec Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Des extraits cellulaires ont été préparés en utilisant une méthode de lyse alcaline78. 1 × 108 cellules provenant de cultures YE en phase logarithmique ont été collectées, lavées avec 1 ml de H2O et mises en suspension dans 300 µl de H2O. Après avoir ajouté 300 µl de NaOH 0,6 M, la suspension cellulaire a été incubée à 30 °C pendant 5 min avec le tube en rotation. Après centrifugation à 6000 tr/min pendant 3 min (TOMY, MX-201), les cellules traitées à l'alcali ont été mises en suspension avec 140 µ de tampon d'échantillon SDS (Tris-HCl 60 mM (pH 6,8), 5 % de glycérol, 4 % de dodécylsulfate de sodium, 4 % de β-mercaptoéthanol, 0,005 % de bleu de bromophénol) et incubées à 95 °C pendant 3 min. Les extraits cellulaires ont été récupérés du surnageant après centrifugation à 15 000 tr/min pendant 1 min (TOMY, Kitman), séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) (rapport acrylamide sur bisacrylamide, 37, 5: 1), et transférés sur PolyScreen PVDF Transfer Membrane (Perkin Elmer, NEF1002001PK). Pour détecter Chk1-HA, un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'étiquette HA (16B12, Abcam, Cambridge, MA) (1:2000) et la peroxydase AffiniPure chèvre anti-souris IgG (lourd + léger) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115–035–146) (1:10 000) ont été utilisés comme anticorps primaires et secondaires, respectivement. Les transferts ont été développés en utilisant le substrat Supersignal West Femto (ThermoScientific, 34095). Les images ont été capturées à l'aide d'ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare).

Le MMS a été ajouté aux cultures d'EMM en phase log à une concentration finale de 0,01 %. À 0, 2, 4, 6 et 8 h après l'ajout de MMS, les cellules ont été récoltées, mises en suspension dans de l'éthanol à 70 % et stockées à 4 °C. Les cellules ont été mises en suspension dans un tampon PEMS (PIPES 100 mM (pH 6,9), EGTA 1 mM, MgSO4 1 mM, sorbitol 1 M), contenant 2 µg mL-1 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et 4 µg mL-1 calcofluor. La suspension cellulaire a été mélangée avec un milieu de montage (90 % de glycérol, 1 mg mL-1 de gallate de n-propyle, 1 mg mL-1 de dichlorhydrate de 1,4-phénylènediamine, 0,1 × solution saline tamponnée au phosphate) sur une lamelle recouverte de poly-L-lysine. À l'aide d'un microscope à fluorescence (BX51, Olympus, Tokyo, Japon) avec un objectif 100 × (NA = 1, 40, Olympus, Tokyo, Japon), les noyaux et les septa ont été visualisés avec du DAPI et du calcofluor, respectivement. Les images ont été obtenues à l'aide d'un appareil photo à couplage de charge (DP72, Olympus, Tokyo, Japon) et traitées à l'aide de cellSens Standard 2.3 (Olympus) et d'Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Des cellules à croissance exponentielle dans un milieu EMM (Rpa2-mCherry) ou YE (Rad52-GFP) ont été collectées, ensemencées sur des boîtes à fond de verre (Matsunami Glass, Osaka, Japon, D11130H) et observées à l'aide d'un système de microscopie à fluorescence personnelle DeltaVision (GE Healthcare), basé sur un microscope à fluorescence IX71 à champ large Olympus équipé d'une caméra CCD CoolSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, Arizona) et d'un objectif à immersion dans l'huile (UAPO 40 × ; NA = 1,35 ; Olympus, Tokyo, Japon). Le pourcentage de noyaux avec des foyers Rpa2-mCherry et Rad52-GFP a été obtenu en comptant les noyaux contenant au moins un foyer Rpa2-mCherry et Rad52-GFP, respectivement, en utilisant ImageJ2 2.9.0 (NIH, États-Unis). > 300 noyaux ont été comptés dans chaque expérience. Trois valeurs expérimentales indépendantes et leurs moyennes ont été présentées dans le graphique à l'aide de GraphPad Prism 9 pour MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA). Les images ont été traitées avec ImageJ2 2.9.0 ou Adobe Photoshop Elements 2020.

Des cellules à croissance exponentielle des souches indiquées ont été préparées et diluées cinq fois en série avec de l'eau stérilisée. 6 µL de chaque dilution ont été déposés sur des plaques YE additionnées de DMSO ou de 5'a-IAA 200 nM (Tokyo Chemical Industry, A3390)51. Les plaques ont été incubées pendant 2 jours. Les images ont été prises avec GT-X800 (Epson, Nagano, Japon) et traitées avec Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Les tests exacts de Mann-Whitney à deux queues et de Fischer à deux queues ont été effectués à l'aide de GraphPad Prism 9 pour MacOS. Le test t de Student bilatéral et le test du chi carré de Pearson ont été effectués à l'aide de Microsoft Excel pour Mac 16.72. La taille de l'échantillon utilisé pour dériver chaque statistique a été fournie dans la légende de la figure ou dans les informations supplémentaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont incluses dans l'article, Informations supplémentaires (Fig. 1 à 6 supplémentaires et Tableaux supplémentaires 1-2) et Données supplémentaires 1-3. Les données de séquence d'ADN de la souche parentale et d'un pool de ségrégants mutants sont disponibles dans DDBJ Sequenced Read Archive sous les numéros d'accès DRX042095 et DRX042098, respectivement, à l'URL suivante : https://ddbj.nig.ac.jp/resource/bioproject/PRJDB4206. Tous les ensembles de données brutes sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Dans cet article, la légende de la figure 1 a été déplacée de sorte qu'elle chevauche une partie de la figure. Ça a désormais été corrigé.

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Nous remercions Akiko Okita, Jie Su et Yukiko Kubota pour leurs commentaires critiques sur le manuscrit et Hirofumi Ohmori et Keiko Kayahara pour leur assistance technique. Nous remercions également Adam T. Watson et Antony M. Carr pour avoir partagé le système AID2. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Numbers 221S0002, JP23570212, JP26114711, 18K06060, 21H02402 et le Uehara Memorial Foundation Grant Number 202120462 à TN.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan.

Département des sciences biologiques, École supérieure des sciences, Université d'Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japon

Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita, Keitaro Oki et Takuro Nakagawa

Forefront Research Center, Graduate School of Science, Université d'Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japon

Piyusha Mongia, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita et Takuro Nakagawa

Centre de recherche en mycologie médicale, Université de Chiba, Chiba, 260-8673, Japon

Hiroki Takahashi

Division de microbiologie, Département de médecine infectieuse, École de médecine de l'Université de Kurume, Kurume, Fukuoka, 830-0011, Japon

Yoshitoshi Ogura

Département de bactériologie, Faculté des sciences médicales, Université de Kyushu, Fukuoka, 812-8582, Japon

Tetsuya Hayashi

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PM, NT et TN ont conçu l'étude. PM, NT et ZP ont réalisé la plupart des expériences avec l'aide technique de RX, YK, KO et TN Le séquençage en profondeur a été réalisé par HT, YO et TH Le manuscrit a été rédigé par TN et PM et approuvé par tous les auteurs.

Correspondance à Takuro Nakagawa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Gerben Vader et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : Manuel Breuer. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Mongia, P., Toyofuku, N., Pan, Z. et al. Les levures de fission Srr1 et Skb1 favorisent la formation d'isochromosomes au centromère. Commun Biol 6, 551 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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Reçu : 14 octobre 2022

Accepté : 09 mai 2023

Publié: 26 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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